·论著·

·死亡时间推断专题·

不同功能基因mRNA推断损伤时间的指标同质性

杜秋香1,2,朱细燕1,3,董塔娜1,2,杨璨羽1,孙俊红1,2

(1.山西医科大学法医学院,山西 晋中 030600;2.法医学山西省重点实验室,山西 晋中 030600;3.陆军军医大学 野战外科研究所第四研究室 车辆/生物碰撞安全重庆市市级重点实验室,重庆 400042)

摘 要:目的探索大鼠骨骼肌挫伤后PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1四个不同功能基因mRNA表达在个体间的同质性高低。方法利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测上述 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 的相对表达量,计算每个损伤组不同个体间的相对表达量的变异系数(coefficient of variation,CV),并比较CV极值、累积变异度、集中趋势(CV)和离散趋势(CVCV)。结果PUM2、TAB2 mRNA在多个时间点出现较大CV,而Cx45、CHRNA1 mRNA的CV较小。累积变异度从大到小依次为PUM2 mRNA、CHRNA1 mRNA、TAB2 mRNA和Cx45 mRNA。PUM2 mRNA 相对表达量的 CVCV高于 TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 的相对表达量(P<0.05)。TAB2、CHRNA1、Cx45 mRNA间相对表达量的CVCV差异无统计学意义(P>0.05)。结论参与生物过程调控作用的PUM2、CHRNA1 mRNA相对表达量个体间同质性最低,其次为TAB2 mRNA,参与细胞结构组成的Cx45、CHRNA1 mRNA相对表达量个体间同质性较高,在今后筛选用于损伤时间推断的mRNA指标时应注意其功能分类。

关键词:法医病理学;创伤和损伤;RNA,信使;肌,骨骼;损伤时间推断;同质性;大鼠

实时荧光定量反转录聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术检测mRNA在组织损伤修复过程中的表达已成为分子生物学的常用方法,mRNA的表达规律也已得到大多数法医学家的关注并尝试用于损伤时间推断[1],但对这些指标在不同个体间表达的同质性及mRNA是否适用于损伤时间推断缺乏系统研究。本课题组在检测不同mRNA随损伤时间的变化规律时发现,部分指标在不同个体间的表达差异极大,而有的指标个体差异性极小。本研究从高通量测序得到的差异基因中筛选参与调控功能的Pumilio 相关蛋白 2(Pumilio homolog 2,PUM2)和转化生长因子β活化激酶1相关结合蛋白2(transforming growth factor-β activated kinase 1 binding protein 2,TAB2)、参与细胞结构组成的缝隙连接蛋白45(connexin 45,Cx45)和烟碱型乙酰胆碱受体 α1亚型(cholinergic receptor nicotinic alpha 1,CHRNA1)四个不同功能基因的mRNA,使用RT-qPCR技术检测大鼠骨骼肌损伤修复过程中mRNA的表达情况并比较其个体间同质性,旨在为损伤时间推断的指标筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制备

健康成年雄性SD大鼠(实验动物由山西医科大学动物中心提供,并通过山西医科大学实验动物使用伦理委员会批准)78只,10周龄,200g左右,随机分为正常对照组和损伤后 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48h 组,每组 6 只。

动物模型采用常规的自由落体法制作大鼠骨骼肌挫伤模型[2-4]。空腹12h后,用3%戊巴比妥钠溶液(40mg/kg)麻醉大鼠。剔除其右后肢毛发后,再用脱毛剂(美国Carter-Wallace公司)清除残余毛发,右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置,用自制固定装置将100g圆柱形重力锤从200cm高度自由落体打击其长内收肌和股薄肌处。控制打击装置的稳定性,使得打击锤能够按固定高度垂直击打,打击锤末端圆柱形钢(半径为14mm)与动物相接触。

模型成功的标准为损伤处可见皮下出血和肌肉挫伤而无胫腓骨骨折。损伤后大鼠分笼饲养并给予充足的饲料和蒸馏水,保持垫料清洁,饲养环境22~25℃,正常光照(与损伤前一致)。在相应时间点,按350mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥钠,处死大鼠。取损伤中心区1.5cm×1.5cm长内收肌和股薄肌处肿胀变红的肌肉组织约50mg置于液氮中备用。

1.2 总RNA的提取及反转录

使用 RNAiso Plus(9108,日本 TaKaRa 公司)提取骨骼肌组织中的总RNA,InfiniteTMM200 pro酶标仪(东胜创新生物科技有限公司)测量总RNA纯度及浓度,D260/D280在1.8~2.0的样本用于后续实验。利用Agilent RNA 6000 Nano试剂盒和Agilent 2100生物分析仪系统(美国Agilent Technologies公司)检测样本中总RNA的完整性,RNA完整性指数(RNA integrity number,RIN)值大于7.0的样本用于后续实验。Prime-ScriptTMRT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)配置10 μL反转录体系,反转录程序:37℃ 15 min,85℃5s。得到cDNA溶液。

1.3 RT-qPCR扩增

1.3.1 探针及引物的设计

从 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genebank)获得基因序列后,使用Allele ID 6.0软件(美国Premier公司)设计并由上海英杰公司合成上下游引物和TaqMan荧光探针,RPL13和RPL32 mRNA作为双内参基因[5]。引物及探针的具体序列见表1。

表1 目的基因与内参基因的引物和探针

基因 基因ID 探针和引物序列 起始位置 荧光基团 淬灭基团 产物长度/bp PUM2 NM_001106715.1 F:5′-AGCTGCATTTGTGCCAAATCC-3′ 982~1002 HEX BQH 121 P:5′-AGTGCTGCTCCTCCAGGGACCGA-3′ 1013~1035 R:5′-CTGAGGTGGAACCACTGCTG-3′ 1102~1083 TAB2 NM_001012062.1 F:5′-ATGACCTGCGACAAAAGTTCC-3′ 211~231 ROX BQH 127 P:5′-AACAGCACAGCAGGCATCCAGGTT-3′ 305~282 R:5′-CCGTAAAGATACCTTGTACTCTCC-3′ 337~314 Cx45 AAN17802.4 F:5′-TAACAGGGCAAACCAATTCCAC-3′ 383~404 ROX BQH 111 P:5′-TTGGAGCTTCCTGACTCGCCTGCT-3′ 414~437 R:5′-TCAGCACAGTGAGCCAGATC-3′ 493~474 CHRNA1 NM_024485.1 F:5′-TCCTTGTTGATGTAGCTCAATGAG-3′ 1270~1291 HEX BQH 163 P:5′-AACACAGCCAGCGTCCCGATGAGA-3′1398~1375 R:5′-AGAGACCATGAAGTCAGACCAG-3′ 1432~1409

续表1

注:F,上游引物;P,Taqman 探针;R,下游引物

基因 基因ID 探针和引物序列 起始位置 荧光基团 淬灭基团 产物长度/bp RPL32 NM_013226.2 F:5′-ATCTGGCCCTTGAATCTTCTCC-3′ 99~121 Cy5 BQH 115 P:5′-TGTCGATGCCTCTGGGTTTCCGCC-3′ 182~159 R:5′-AGAGGACCAAGAAGTTCATCAGG-3′ 213~192 RPL13 NM_031101.1 F:5′-TCGTGAGGTGCCCTACAGTTAG-3′ 209~230 FAM BQH 107 P:5′-CACACCAAGGTCCGGGCTGGCAG-3′ 235~257 R:5′-GGTGCGTGCCATTTTCTTGTG-3′ 315~295

1.3.2 RT-qPCR扩增

用PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)中的EASY Dilution稀释cDNA溶液,配制成梯度浓度为 1∶50、1∶51、1∶52、1∶53 和 1∶54 的标准品。以梯度浓度cDNA为模板,进行RT-qPCR扩增反应,绘制标准曲线,评判目的基因扩增效率是否与内参基因一致。整个实验设阴性对照组(不加入cDNA),每个样本重复检测两次。

超净工作台中,在冰盒上使用Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)试剂盒(日本TaKaRa公司)配置25μL RT-qPCR扩增体系,在Mx3000P qPCR系统(美国Agilent Technologies公司)中进行RT-qPCR扩增反应。 扩增条件:95℃ 10 s,1 个循环;95℃ 5 s,60℃40s,重复40个循环。

1.4 数据分析和统计学处理

计算基于双内参基因的PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 的相对表达量(2-ΔΔCt法,±s)及变异系数(coefficient of variation,CV),用以下三种方法比较 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 表达个体间的同质性:

(1)评估每个时间点 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA表达量的CV中有无极值出现。

(2)求累积变异度。在每个时间点,根据PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 表达量的 CV,从小到大排序赋值 1、2、3、4分(若 CV 相同,取两赋值的均值)。每个mRNA指标得到13个分值,分值之和即为该mRNA指标的累积变异度。

(3)比较 CV 的集中趋势(CV)和离散趋势(CVCV)。每个指标均有13个CV,统计描述为CV±SCV,比较并分析四个mRNA相对表达量CV的平均水平;CV小者变异度低,同质性高。进一步比较四个mRNA相对表达量CV的离散度(CVCV):

CVCV较小者变异度低,同质性高。

使用SPSS 24.0对CV进行ANOVA和SNK检验。检验水准α=0.05。

表2 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 相对表达量的累积变异度 (n=6)

注:“-”表示无合计值

组别 PUM2 mRNA TAB2 mRNA Cx45 mRNA CHRNA1 mRNA CV 分值 CV 分值 CV 分值 CV 分值对照 0.58 4 0.50 3 0.15 1 0.44 2损伤后4h 0.52 4 0.25 1 0.34 2 0.47 3损伤后8h 0.66 4 0.44 1.5 0.44 1.5 0.45 3损伤后12h 0.78 4 0.32 1 0.41 2 0.46 3损伤后16h 0.39 2 0.48 3 0.31 1 0.49 4损伤后20h 0.70 4 0.24 1 0.50 3 0.44 2损伤后24h 0.75 4 0.39 2 0.45 3 0.29 1损伤后28h 0.56 4 0.40 2 0.31 1 0.49 3损伤后32h 0.42 3 0.50 4 0.36 1 0.38 2损伤后36h 0.63 4 0.49 3 0.37 2 0.32 1损伤后40h 0.59 4 0.31 2.5 0.31 2.5 0.25 1损伤后44h 0.26 2 0.19 1 0.48 4 0.45 3损伤后48h 0.55 3 0.66 4 0.38 1 0.45 2合计 - 46 - 29 - 25 - 30

2 结 果

2.1 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 相对表达量的CV

从表 2 可见:对照组和损伤后 4、8、12、20、24、28、36、40 h组的PUM2 mRNA相对表达量CV较大,超过0.50;在对照组和损伤后32h、48h组,TAB2 mRNA相对表达量CV较大,达到或超过0.50;在损伤后20h组,Cx45 mRNA相对表达量CV也达到0.50;而CHRNA1 mRNA在所有损伤组的相对表达量CV均未超过0.50。

2.2 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 相对表达量的累积变异度

从表2可知,四个mRNA相对表达量的累积变异度从大到小分别为PUM2 mRNA、CHRNA1 mRNA、TAB2 mRNA、Cx45 mRNA。

2.3 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 相对表达量CV的集中趋势与离散趋势

方差分析显示,四组CV不全相等(P<0.05)。进一步SNK检验发现,PUM2 mRNA表达量的CV与其他三者的差异均有统计学意义(P<0.05),即PUM2 mRNA相对表达量的CV高于TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA。 而 TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 相对表达量的CV之间差异无统计学意义(P>0.05,表 3)。

从表3可知,CVCV从大到小分别为TAB2 mRNA、PUM2 mRNA、Cx45 mRNA、CHRNA1 mRNA,但各指标间差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 PUM2、TAB2、Cx45和 CHRNA1 mRNA 的 CVCV(n=6)

注:1)与 PUM2 mRNA相对表达量的CV相比,P<0.05

基因CV±SCVCVCVPUM2 mRNA 0.57±0.15 0.26 TAB2 mRNA 0.40±0.131)0.33 Cx45 mRNA 0.37±0.091)0.25 CHRNA1 mRNA 0.41±0.081)0.19

3 讨 论

RT-qPCR技术可以准确、快速、灵敏地检测损伤后组织中mRNA的含量,而这种含量随时间变化的规律即可应用于损伤时间推断[6]。组织损伤后多种基因的mRNA表达都会发生变化,细胞内mRNA相对表达量及蛋白相对表达量主要由mRNA的合成速率和mRNA自身的半衰期两个因素决定,但是近些年发现后者的贡献更大,即mRNA稳定性对细胞内mRNA相对表达量起着决定作用[7-8]。若细胞内某mRNA含量变化太快,即mRNA数据变异度大,则使用RT-qPCR在不同个体乃至同一个体中检测该mRNA时,得到的数据就可能不一致。mRNA作为推断损伤时间的指标时,在相同处理条件下,mRNA数据是否均一关系到损伤时间推断的准确性。若mRNA数据变异度大,则损伤时间推断的窗口较大;若mRNA数据高度一致,则可以缩小损伤时间推断的窗口。此外,有研究[9-10]指出,mRNA的表达在个体内和个体间变异过大,不利于损伤时间推断。因此,寻找个体内和个体间变异较小的mRNA是利用mRNA推断损伤时间要解决的首要问题。

PUM2是一种转录后调控因子,能通过其特定的结构域与mRNA靶向结合以阻断翻译起始复合物的形成,抑制靶基因的表达[11]。在骨骼肌中,PUM2调节肌细胞的收缩[12]。TAB2在机体免疫反应的调控中主要促进炎症反应及时有效地终止[13]。本研究中,TAB2 mRNA在骨骼肌损伤修复中的相对表达量降低,可能是因为在损伤早期肌细胞主动降低炎症的抑制因素,增强炎症反应,吞噬坏死、溶解的组织细胞,为后期骨骼肌的再生与重塑作准备。Cx45是一种缝隙连接通道蛋白,参与电信号在细胞之间传递。处于发育阶段的成肌细胞或损伤细胞中Cx45等缝隙连接蛋白的表达较多[14],缝隙连接蛋白参与肌细胞增殖、分化、聚集及融合,促进骨骼肌组织损伤修复[15]。CHRNA1是烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)的重要亚型之一,可与AChR结合并激活后者,引起节神经元和骨骼肌兴奋[16]。本研究发现,骨骼肌损伤后 16、24、40、44、48h CHRNA1 mRNA 的表达上调,可能是由于损伤骨骼肌内CHRNA1也受到了形态或功能上的损害,细胞受到刺激后新合成CHRNA1 mRNA,为蛋白分子的合成作准备。

本研究从CV极值的存在与否、累积变异度大小、CV的集中趋势和离散趋势三个角度,分析PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 表达在个体间的同质性大小。大鼠骨骼肌损伤48h内,PUM2、TAB2 mRNA相对表达量在多个时间点出现较大CV,而Cx45、CHRNA1 mRNA相对表达量的CV较小,累积变异度从大到小分别为PUM2 mRNA、CHRNA1 mRNA、TAB2 mRNA和Cx45 mRNA,PUM2 mRNA相对表达量的CV比 TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 的相对表达量高,但尚不能认为 TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA三者相对表达量之间存在差别。在一定程度上,CVCV也反映四个指标在损伤后个体间mRNA表达的同质性。SNK分析结果并不支持TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA相对表达量CV的平均水平存在统计学差异,所以进一步分析CVCV发现,另三个CVCV从大到小分别为 TAB2 mRNA、Cx45 mRNA、CHRNA1 mRNA。以上结果表明,在大鼠骨骼肌挫伤修复中,PUM2 mRNA的同质性最低,TAB2 mRNA次之,Cx45 mRNA和CHRNA1 mRNA的同质性较高。由此可见,参与生物过程调控作用的PUM2 mRNA和TAB2 mRNA表达在不同生物个体间差异较大,而作为细胞结构组成的Cx45 mRNA和CHRNA1 mRNA在不同生物个体间表达差异较小。

综上所述,参与生物过程调控作用的mRNA可能导致RT-qPCR在同一个体或不同个体间检测得到的数据不一致,即mRNA数据离散度大,同质性低,而参与细胞结构组成的mRNA指标同质性较高,因此在筛选用于损伤时间推断的指标时应注意其功能分类。

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Homogeneity of Different Functional mRNA Indicators for Wound Age Estimation

DU Qiu-xiang1,2,ZHU Xi-yan1,3,DONG Ta-na1,2,YANG Can-yu1,SUN Jun-hong1,2
(1.School of Forensic Medicine,Shanxi Medical University,Jinzhong 030600,Shanxi Province,China;2.Shanxi Key Laboratory of Forensic Science,Jinzhong 030600,Shanxi Province,China;3.Chongqing Key Laboratory of Vehicle Crash/Bio-Impact and Traffic Safety,4th Department,Institute of Surgery Research,Army Medical University,Chongqing 400042,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the homogeneity level of four different functional mRNA (PUM2,TAB2,Cx45 and CHRNA1)expressions in rats with skeletal muscle contusion.MethodsThe relative expressions of PUM2,TAB2,Cx45 and CHRNA1 mRNAs were detected by quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-qPCR).The coefficient of variation (CV) of the relative expressions for different individuals in each injury group was calculated.The extreme value of CV,cumulative variability,and CVCVwere compared.ResultsA high CV of PUM2 and TAB2 mRNAs appeared on several different time points.However,the CV of Cx45 and CHRNA1 mRNAs was relatively low.The cumulative variability from high to low was PUM2,CHRNA1,TAB2 and Cx45 mRNAs.The relative expression of PUM2 mRNA was significantly higher than that of TAB2,Cx45 and CHRNA1 mRNAs(P<0.05).There was no statistical significance (P>0.05) in the CVCVof the relative expression of TAB2,CHRNA1 and Cx45 mRNAs.ConclusionAs the mRNAs involving in biological process regulation,PUM2 and CHRNA1 mRNAs show a lowest individual homogeneity of the relative expression followed by TAB2 mRNA.As the mRNAs participating in the composition of cellular structure,Cx45 and CHRNA1 mRNAs show a high individual homogeneity of the relative expressions.The functional classification should be considered for the screening of the mRNA indicators used for wound age estimation.

Keywords:forensic pathology;wounds and injuries;RNA,messenger;muscle,skeletal;wound age estimation;homogeneity;rats

通信作者孙俊红,男,博士,教授,主要从事损伤病理学和猝死病理学研究;E-mail:junhong.sun@sxmu.edu.cn

作者简介:杜秋香(1982—),女,博士,副教授,主要从事损伤病理学研究;E-mail:qiuxiang.du@sxmu.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金资助项目(81601646);国家自然科学基金面上基金资助项目(81571852)

文章编号:1004-5619(2018)05-0487-05

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2018.05.006

文献标志码:A

中图分类号:DF795.1

收稿日期:2018-06-13)

(本文编辑:李正东)