·技术与应用·

藻类rDNA特异性片段长度多态性在溺死鉴定中的应用

袁文勇,汤晓蕙,周顺平,俞卫东

(南京市公安局刑事科学技术研究所,江苏 南京 210012)

摘 要:目的通过检验水体和人体器官中硅藻核糖体DNA(rDNA)5.8S部分序列、第二内转录间隔区(second internal transcribed spacer,ITS2)序列(5.8S+ITS2)的长度多态性差异,判断溺水死亡案件中受害人的落水地点以及受害人系生前落水还是死后被抛尸入水。方法以南京市公安局法医中心受理的2例硅藻检验鉴定案例为对象,利用5.8S+ITS2分子标记的长度多态性,分析藻类生物在水体、人体组织中种群结构的差异。结果案例1中,在受害人肺、肝组织和水体样本中均检出种类相近的硅藻,利用5.8S+ITS2分子标记在死者肺组织和水体样本中均检出330bp和376bp两种DNA片段,确定受害人系生前溺水。案例2中,在死者肺、肝组织中均未检出硅藻,利用5.8S+ITS2分子标记在死者肺组织中仅获得1条DNA片段,长度为331bp,相对荧光单位值非常低,确定受害人系死后抛尸入水。结论本方法检验两案例的实验结果符合实际案情和硅藻镜检的结论,利用5.8S+ITS2分子标记研究水体和人体组织中特定微生物的种群结构差异,从而判断溺水死亡的落水地点以及受害人系生前落水还是死后被抛尸入水等问题具有可行性。

关键词:法医病理学;法医遗传学;硅藻类;DNA,核糖体;第二内转录间隔区;扩增片段长度多态性分析;溺死

法医需要对溺水死亡案件中受害人溺水地点、生前溺水或是死后抛尸入水等问题进行判断。目前,硅藻检验的结果是判断上述问题的重要参考之一。硅藻检验的方法很多,包括强酸消化法、胰蛋白酶消化法等[1-2],这些方法的基本原理仍然是依据硅藻的形态学差异进行判断。目前,已有利用现代分子生物学技术在溺水死亡案件鉴定方面作出开拓性研究成果的报道,何方刚等[3]以大鼠为实验动物,利用PCR扩增和变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)的方法,比较水体和溺水大鼠肺、肝、肾、脑等组织中浮游生物16S核糖体DNA(rDNA)第三区和第四区特异性DNA片段序列、长度的差异,结果显示溺死组5只大鼠肺组织全部检出阳性结果,抛尸组仅1只大鼠检出阳性结果。

目前,利用新的遗传标记对藻类进行种属鉴定以及藻类系统发育学的研究已经取得了长足的进步。研究者致力于寻找一种可以有效鉴别不同藻类、浮游生物的分子标记。在rDNA基因中,5.8S rDNA和28S rDNA基因之间的间隔序列称为内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列,其长度和碱基序列具有高度特异性,被形象地称为“藻类鉴定条形码”。MONIZ等[4]比较了核糖体小亚基(small subunit ribosomal ribonucleic acid,SSU rRNA)序列、细胞色素 c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ,Cox1)、核糖体DNA 5.8S部分序列和第二内转录间隔区(second internal transcribed spacer,ITS2)序列(5.8S+ITS2)三种主要藻类分子标记后,认为5.8S+ITS2分子标记是目前藻类种属鉴定、系统发育分析最好的遗传标记。由于气候、水文条件的差异,不同水体中优势种群的藻类组成具有显著的差异,VINAYAK等[5]以水体中111个硅藻种类为研究对象,在不同位置、不同季节均发现特异性硅藻种类,可为落水地点和落水时间的判断提供依据。因此,利用5.8S+ITS2分子标记对特定水域与溺水者肺、肝、肾等组织中藻类种属构成的差异进行分析,可以对死者溺水地点以及生前溺水或死后抛尸入水的判断提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验样本

以南京市公安局法医中心受理的2例硅藻检验鉴定案例为对象,其中:案例1为一起落水死亡案件,受害人为女性,系生前遭人殴打并推入水中溺亡;案例2是一起弃婴案件,系婴儿死亡后抛尸入水。

提取受害人肺、肝、肾、骨髓等组织于-20℃冷冻保存,取受害人落水地(发现地)水域的水体样本于-20℃冷冻保存。

1.2 DNA提取

水体中藻类DNA的提取采用先富集后液氮研磨的方法,人体组织中藻类在提取DNA之前需尽量去除人体组织的DNA,同时在检验过程中取适量受害人血液样本的DNA作为对照。以上样本均按照二氧化硅吸附法提取和纯化[6]。用紫外分光光度计检测提取产物在260 nm和280 nm波长下光密度的比值(D260/D280),以检测DNA的纯度和浓度。

1.3 PCR扩增与DNA片段检测

PCR扩增体系总体积为25 μL,内含终浓度为200 μmol/L dNTPs 10 μL、1.5 mmol/L MgCl21 μL、1.5μmol/L引物对 5μL、0.5U Taq DNA 聚合酶 1μL,模板量为5~20ng,其余用去离子水补齐。同一案例的水体和肺组织中扩增模板量一致。其中,扩增藻类5.8S+ITS2 序列所使用正向引物(5′→3′)为 6-FAMGCATCGATGAAGAACGCAGC,反向引物(5′→3′)为TCCTCCGCTTATTGATATGC[7],引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增条件:94℃预变性 11 min;95℃变性 30 s,53℃退火 40 s,72℃延伸45s,30 个循环;60℃保温 20min。

扩增产物在3130xl基因分析仪(美国AB公司)上进行检测,获得的数据采用GeneMapper®ID-X v1.4软件(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行分析。

1.4 硅藻镜检

人体组织和水体中的硅藻鉴定按照《人体组织器官中硅藻硝酸破机法检验》(GA/T 813—2008)、《法医病理学检材的提取、固定、包装及送检方法》(GA/T 148—1996)规定的操作进行,经发烟硝酸消化、离心、洗涤、制片、镜检,镜检采用40倍物镜观察、拍照固定。

2 结 果

2.1 藻类DNA检测结果

案例1中:水体样本DNA提取产物的D260/D280为1.75,质量浓度为10ng/μL;受害人肺组织DNA提取产物的D260/D280为1.78,质量浓度为50ng/μL。经上述方法检测分析的结果见图1。受害人肺组织的藻类DNA检测中,检出长度为330bp和376bp两条DNA片段。水体样本的藻类DNA检测中,检出了330bp、348bp、352bp、376bp、385bp 等长度不一的多条 DNA片段,其中包含330bp和376bp两条片段。受害人血液样本的DNA扩增产物在300 bp至400 bp区间未获得明显DNA条带。

案例2中:水体样本DNA提取产物的D260/D280为1.73,质量浓度为12ng/μL;受害人肺组织DNA提取产物的D260/D280为1.74,质量浓度为45ng/μL。经上述方法检测分析的结果见图2。受害人肺组织的藻类DNA检测中,在300bp至400bp区间只有一条331bp的DNA片段检出。水体样本的藻类DNA检测中,检出 331 bp、368 bp、376 bp、395 bp 等长度不一的多条DNA片段,其中包含331 bp片段,但相同DNA模板量和扩增条件下,受害人肺组织中检出的DNA片段相对荧光单位(relative fluorescence unit,RFU)值只有300,而水体样本中相应片段RFU值为3800。对受害人血液样本进行对照扩增检测,未检出藻类DNA片段。

图1 案例1的藻类DNA检测结果

A:肺组织;B:水体样本;C:血液;黄色峰为DNA内标片段,蓝色峰为目标DNA片段

图2 案例2的藻类DNA检测结果

A:肺组织;B:水体样本;C:血液;黄色峰为DNA内标片段,蓝色峰为目标DNA片段

2.2 硅藻镜检结果

对案例1中受害人的肺、肝、肾、骨髓组织以及疑似落水点水体样本中硅藻进行镜检。水体样本中检出中心目硅藻13个、羽纹目硅藻70个,肺组织中检出中心目硅藻3个、羽纹目硅藻44个,肝组织中检出中心目硅藻1个、羽纹目硅藻2个,肾和骨髓组织中未检见硅藻。结合案例1实际案情,硅藻检验结果符合生前溺水的特征。

对案例2中受害人的肺、肝、肾以及疑似落水点水体样本中硅藻进行镜检。水体样本中检出中心目硅藻16个、羽纹目硅藻36个,肺、肝、肾组织中均未检出硅藻。案例2中的受害人是无名弃婴,系死亡后被抛入水中,硅藻检验结果符合死后抛尸入水的特征。

3 讨 论

3.1 分子标记的选择

5.8 S+ITS2分子标记一直是真菌类种属鉴定的有效工具,SCHOCH等[8]分析了RNA聚合酶Ⅱ最大亚基、RNA聚合酶Ⅱ第二亚基等多个候选分子标记发现,ITS序列是鉴定真菌最有效的分子标记之一。MONIZ等[9]分析了618个硅藻DNA片段,运用5.8S+ITS2分子标记检测具有非常高的种属特异性和片段扩增成功率,是最为有效且经济的鉴定标记。此外,为了获得更高的多态性,可以选择多个分子标记携带不同颜色的荧光修饰基团进行扩增分析。本研究发现,人体组织中获得的DNA片段条带数均明显低于水体样本中检出的条带数,由于较少的DNA片段限制了鉴定意见的分析,因此有必要增加分子标记,在人体组织中获得更多的目标DNA片段。WHITE等[7]推荐的序列还包括核糖体大亚基和小亚基的部分特异性序列以及线粒体DNA序列中的多个分子标记,选择合适的标记组合是下一步研究的任务。

3.2 DNA提取方法对检测结果的影响

水体样本中藻类DNA的提取方法主要是通过高速离心、富集水体中浮游藻类、液氮研磨破碎细胞来提取总DNA。对于受害人肺组织中藻类DNA的提取则有所不同,需先通过含有蛋白酶K的混合缓冲溶液消化肺组织,高速离心后弃去上清液保留沉淀,其目的是尽量去除人体组织中的DNA。由于藻类生物中有部分是没有细胞壁的单细胞浮游藻类,这一方法将不可避免地导致损失部分藻类,可能是肺组织中检出的DNA片段条带数少于水体样本的原因之一。本研究也曾尝试直接用液氮研磨肺组织然后提取总DNA,检测结果不理想,可能是该方法提取的DNA主要是人体组织DNA的缘故。如何提取肺组织中的藻类DNA也是本研究的难点之一,目前看来,先去除人体组织的DNA是较为理想的方法。

3.3 检测结果与分析

案例1中,根据尸体检验、案情调查和硅藻检验结果,都支持受害人系生前溺水,本研究在受害人肺组织和水体样本中均检出330bp和376bp两种5.8S+ITS2 DNA片段,水体样本中还检出了348bp、352bp等多条DNA片段。案例2中,硅藻镜检仅在水体样本中检出硅藻,受害人肺、肝、肾组织中均未检出硅藻,案情调查证实,受害人(婴儿)在医院经治疗无效死亡后被抛入水中。本研究在受害人肺组织中仅检出一条331 bp的5.8S+ITS2 DNA片段,RFU值为300,量非常少,水体样本中则检出 331bp、368bp、376bp、395bp等长度的DNA片段,具有较高的多样性,其中也包括331bp片段,其RFU值为3800。本研究结果显示:生前溺水死亡的死者肺组织中的硅藻DNA片段与水体样本中的硅藻DNA片段在大小、种类等方面有更高的一致性,而死后抛尸入水的案例则未在肺组织中检出特异性DNA片段。本研究也对受害人肝、肾等组织进行了检验,受限于缺乏高效的藻类DNA提取手段未能检出特异性DNA片段。此外,受害人组织和水体样本中的DNA片段多态性相似程度达到何种标准时可以出具支持抛尸入水或生前溺水的鉴定意见,同样需要在检验大量案例并进行统计分析的基础上,将5.8S+ITS2分子标记检验的结果结合实际案情、尸体检验及组织病理学检验结果,最终得出结论。

参考文献:

[1]郭景元.现代法医学[M].北京:科学出版社,2000:388-390.

[2]祝家镇.法医病理学[M].2版.北京:人民卫生出版社,1999:263-266.

[3]何方刚,黄代新,刘良,等.PCR-DGGE法检测浮游生物16S rDNA在溺死鉴定中的应用[J].中国法医学杂志,2008,23(4):234-237.

[4]MONIZ M B,KACZMARSKA I.Barcoding diatoms:is there a good marker?[J].Mol Ecol Resour,2009,9(Suppl 1):65-74.

[5]VINAYAK V,MISHRA V,GOYAL M K.Diatom fingerprinting to ascertain death in drowning cases[J].J Forensic Res,2013,4(5):1000207.

[6]王林生,苏勇,顾林岗.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中国法医学杂志,2000,15(1):36-37.

[7]WHITE T J,BRUNS T,LEE S,et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//INNIS M A,GELFAND D H,SNINSKY J J,et al.PCR protocols: a guide to methods and applications.London: Academic Press,1990:315-322.

[8]SCHOCH C L,SEIFERT K A,HUHNDORF S,et al.Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS)region as a universal DNA barcode marker for Fungi[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(16):6241-6246.

[9]MONIZ M B,KACZMARSKA I.Barcoding of diatoms: nuclear encoded ITS revisited[J].Protist,2010,161(1):7-34.

Application of Specific Fragment Length Polymorphism of Algae rDNA in Identification of Drowning Cases

YUAN Wen-yong,TANG Xiao-hui,ZHOU Shun-ping,YU Wei-dong
(Institute of Criminal Science and Technology,Nanjing Public Security Bureau,Nanjing 210012,China)

Abstract:ObjectiveTo identify the drop-off location of victims in drowning cases,and confirm whether it is a fatal drowning or the victim is thrown into the water after death by detecting part of 5.8S sequence and second internal transcribed spacer (ITS2) (5.8S+ITS2) of diatom rDNA in water and organs.MethodsTwo cases identified by diatom examination,which received by Nanjing Municipal Public Security Bureau Forensic Center,were taken as the research objects.The difference of the population structure of algae in water and human tissue was analysed by length polymorphism of 5.8S+ITS2 marker.ResultsIn case 1,similar species of diatom were detected from victim’s lung and liver tissues and the water sample.Two kinds of DNA fragments with length of 330 bp and 376 bp were detected from victim’s lung tissue and the water sample using 5.8S+ITS2 marker,which could confirm the victim was drowning before death.In case 2,there was no diatom found in victim’s lung and liver tissues.Only one kind of DNA fragment with length of 331bp and low relative fluorescence unit(RFU) was obtained from victim’s lung tissue using 5.8S+ITS2 marker,thus the victim was thrown into the water after death.ConclusionThe experimental results of the two cases in present study are consistent with the actual facts and the result of the diatom microscopic examination.The difference of population structure of specific microorganism in water and human tissue can be detected by 5.8S+ITS2 marker,which can help to identify the drop-off location of victims in drowning cases,and confirm whether it is a fatal drowning or the victim is thrown into the water after death.

Keywords:forensic pathology;forensic genetics;diatoms;DNA,ribosomal;second internal transcribed spacer;amplified fragment length polymorphism analysis;death from drowning

作者简介:袁文勇(1984—),男,硕士,主检法医师,主要从事法医物证学鉴定和法医遗传学研究;E-mail:632976659@qq.com

基金项目:南京市公安局科研资助项目(K2013016)

文章编号:1004-5619(2018)05-0516-04

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2018.05.016

文献标志码:A

中图分类号:DF795.1

收稿日期:2016-12-26)

(本文编辑:邹冬华)