·技术与应用·

miniSTR基因座及其检测系统在降解检材中的法医学应用

王 鑫1,陈维忠1,张 健1,李景辉1,孙元鹏1,石云杰1,张 雷2,陈林丽2,周 翔2,周如华1

(1.苏州市公安局物证鉴定所,江苏 苏州 215131;2.无锡中德美联生物技术有限公司,江苏 无锡 214174)

摘 要:目的建立16个miniSTR基因座的复合扩增体系,探讨其在法医学降解检材中的应用价值。方法采用六色荧光标记技术,对16个miniSTR基因座进行复合扩增体系的构建及法医学应用评估。结果开发出一个六色荧光标记的miniSTR扩增试剂盒,可同时对15个常染色体STR基因座、Amelogenin基因座和DYS391基因座进行分型检测,方法特异性好,分型结果稳定、准确,灵敏度达50pg,实际案件中常见生物检材的检验结果良好。结论16个miniSTR复合扩增体系对降解与微量检材的检测具有应用价值,灵敏度高,具有数据库兼容性,可以用于实际案件检验。

关键词:法医遗传学;短串联重复;降解检材;微量检材;复合扩增体系

20世纪90年代,短串联重复(short tandem repeat,STR)序列遗传标记开始应用于法医物证学的研究及鉴定[1]。STR基因座的复合扩增技术以灵敏、准确、快速、信息量大等优点被广泛应用于个体识别和亲子鉴定[2-3]。然而,在法医物证学鉴定过程中,现场生物检材的提取、保存及送检容易受到环境影响,导致DNA分子结构降解、DNA含量降低以及抑制剂浓度增高,从而影响DNA检验及分型[4-7]。如何对降解和微量的生物检材进行DNA检验已成为法医物证学检验的一大难点。使用常规的荧光标记STR试剂盒对降解和微量的生物检材检验,经常会出现长片段的STR基因座丢失或者检验失败。本研究拟采用miniSTR技术,即通过在STR基因座核心重复序列的侧翼序列设计引物,尽可能缩短复合扩增产物的片段,从而提高STR分型成功率[8-10]

1 材料与方法

1.1 样本

652份实际案件样本(血迹112份,烟蒂135份,精斑30份,肋软骨10份,脱落细胞365份),均来源于苏州市公安局物证鉴定所;种属特异性测试样本——狗、猪、牛、羊、鼠、猫、兔和大肠杆菌购于市场[猪、牛、羊购于当地菜市场,鼠、兔血样采集于温州医科大学实验动物中心,狗、猫DNA采集宠物狗和宠物猫唾液样本,大肠杆菌菌种购买于生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.2 DNA提取和定量

DNA提取采用ReadyAmpTM基因组DNA提纯系统(genomic DNA purification system,美国 Promega公司)、磁珠DNA提取试剂盒(苏州新海生物科技股份有限公司)和AGCU高效硅珠DNA提取纯化试剂盒(无锡中德美联生物技术有限公司)提取,对使用磁珠和硅珠提取的DNA采用Qubit®3.0荧光定量仪(美国Life Technologies公司)进行定量。

1.3 复合PCR扩增体系的建立

1.3.1 STR基因座选择及miniSTR引物设计

本研究最终构成的复合扩增体系包含15个来自AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR 扩增试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)的常染色体STR基因座,1个Y染色体基因座DYS391以及Amelogenin(表1)。使用Primer Premier 5.0和Oligo 7设计引物(表2),复合扩增体系中的各引物满足以下条件:引物碱基分布随机、Tm值相近、GC含量在40%~60%、引物自身及引物之间不应存在互补序列[11]。使用BLAST®(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对设计的引物进行比对分析。

表1 17个遗传标记的相关信息

注:1)内标为 SIZ-500;2)为常用染料;3)为新型能量转移荧光素

基因座 片段范围/bp1)等位基因范围/bp 荧光标记 标准品9948基因型D3S1358 111.2~147.5 8~21 FAM2)15/17 D13S317 151.4~196.0 5~17 FAM2)11 D7S820 201.4~245.2 5~16 FAM2)11 D16S539 255.5~300.0 4~16 FAM2)11 D2S1338 96.8~162.2 10~29 HEX2)23 TH01 165.1~207.3 3~13.3 HEX2)6/9.3 D18S51 212.4~293.5 6~29 HEX2)15/18 Amelogenin 105.2~110.6 X,Y VIG5503)X/Y TPOX 115.5~155.4 4~16 VIG5503)8/9 vWA 171.6~230.7 10~25 VIG5503)17 D21S11 235.0~295.5 23.2~39 VIG5503)29/30 DYS391 80.3~107.4 5~16 VIG5983)10 D8S1179 125.3~178.5 4~20 VIG5983)12/13 D5S818 194.9~238.2 6~19 VIG5983)11/13 CSF1PO 245.7~286.0 5~16 VIG5983)10/11 D19S433 107.4~148.6 5.2~19.2 VIG6183)13/14 FGA 157.6~307.8 12~52.2 VIG6183)24/26

表2 17个基因座的引物信息及浓度

基因座 引物序列(5′→3′) 引物浓度/(μmol·L-1)D3S1358 F:TGTGCCTTTGGGGGCATCTCTT 0.60 R:TGACAGAGCAAGACCCTGTCTCA 0.60 D13S317 F:CTTCAACTTGGGTTGAGCCAT 0.45 R:GTGACTCTCTGGACTCTGACCCAT 0.45 D7S820 F:TGTCATAGTTTAGAACGAACTAAC 0.50 R:GGTATCAAAAACTCAGAGGGAA 0.50 D16S539 F:GGGAGCAAACAAAGGCAGATCCC 0.60 R:TTTGAAACTGTGTCATTAGGTTTT 0.60 D2S1338 F:TAAGTTAAAGGATTGCAGGAG 1.00 R:ATTACAGAAATGGCTTGGC 1.00 TH01 F:TGGGCTGAAAAGCTCCCGATTA 0.55 R:CCATTGGCCTGTTCCTCCCTTA 0.55 D18S51 F:GTGAGCCATGTTCATGCCACTGCAC 0.90 R:AATAACAGTTGCTACTATTTCTTTTCT 0.90

续表2

注:F表示正向引物;R表示反向引物

基因座 引物序列(5′→3′) 引物浓度/(μmol·L-1)Amelogenin F:TGTGTTGATTCTTTATCCCAG 0.65 R:GACACAGGCTTGAGGCCAACC 0.65 TPOX F:TGATCACTAGCACCCAGAACCGTCG 0.80 R:GGGCAAATAAACGCTGACAA 0.80 vWA F:TGAGTTGTGAAAGCCCTAGTGG 0.60 R:ATAGAGATAGGACAGATGATA 0.60 D21S11 F:AGTCTCCATAAATATGTGAGTCA 0.86 R:ATTAAAGATGTTGTATTAGTCA 0.86 DYS391 F:AATCATACACCCATATCTGTCTGTCT 0.70 R:ATAGAGGGATAGGTAGGCAGGCA 0.70 D8S1179 F:TTTTGTATTTCATGTGTACATT 0.95 R:CGTATCCCATTGCGTGAATATGCC 0.95 D5S818 F:TTTTCCTCTTTGGTATCCTTA 0.75 R:TAAGCAAAAAAGTAATTGTCTC 0.75 CSF1PO F:ACCCAACCCACATGGTGCCA 0.65 R:TGCCAAGGACTAGCAGGTTGCT 0.65 D19S433 F:AAAAGCTATAATTGTACCACTGCA 0.80 R:TACATGAATAAGTTCTTTAGCAGT 0.80 FGA F:CACAGATTAAACTGTAACCAAAATAA 1.00 R:CTGAGTGATTTGTCTGTAATTGCCAGC 1.00

1.3.2 PCR扩增条件

PCR反应体系包含:PCR扩增缓冲液Master Mix(无锡中德美联生物技术有限公司)10μL,六色mini引物 5μL,基因组 DNA 0.1~2.0ng,纯水补至 25μL。扩增使用9700型PCR仪(美国AB公司),根据试剂盒说明书推荐的循环条件:95℃ 5min;94℃ 15s,59℃ 50s,65℃ 30s,循环 29次;60℃ 7min。扩增产物于4℃保存。

1.3.3 电泳及STR分型

1 μL的PCR产物与0.5 μL内标(无锡中德美联生物技术有限公司,Marker SIZ-500,SIZ荧光标记)和10μL去离子甲酰胺(美国Thermo Fisher Scientific公司)混合,95℃变性3min后冰浴,电泳检测。使用3500xL基因分析仪(美国AB公司)以1.2kV 24s进行电泳分离,使用GeneMapper®ID-X 1.4软件(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行结果分析。

1.3.4 等位基因分型标准物的制备

使用荧光标记引物扩增不同检材,收集17个基因座上不同等位基因的样本。使用非荧光标记引物对收集到的样本进行单基因座扩增,并使用分子克隆技术和碱裂解法制备17个基因座的不同等位基因质粒,以质粒为模板,使用每个基因座对应的荧光标记引物分别使用9700型PCR仪进行PCR扩增,并混合扩增产物,经组合调平,最终制成等位基因分型标准物。

1.4 扩增体系技术指标验证

1.4.1 分型一致、种属特异性及稳定性验证

652份案件样本按本研究方法进行扩增与分型检测,其中常染色体基因座分型结果与AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒分型结果进行比较,DYS391分型结果与YfilerTMPlus PCR扩增试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)分型结果进行比较。

种属特异性验证分别采用狗、猪、牛、羊、鼠、猫、兔和大肠杆菌等生物检材,提取DNA后使用上述复合扩增体系进行PCR扩增检验,检测是否出现特异的DNA分型。

将试剂盒中的试剂PCR扩增缓冲液、六色mini引物、等位基因ladder和内标SIZ-500进行反复冻融和复合扩增检验,冻融次数分别为10、15、20次。

1.4.2 灵敏度、混合样本、抗抑制能力及扩增循环次数验证

灵敏度验证选用DNA标准品9948(美国Promega公司),根据浓度进行倍比稀释,取总模板量分别为500、250、125、50、30 pg 的DNA 标准品 9948 进行平行重复检测3次。

混合样本制备选用DNA标准品9947A(美国Promega公司)和9948,根据定量结果及浓度分别按19∶1、9∶1、5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5、1∶9、1∶19 的比例混合,模板总量为1ng,平行重复检测3次。

抑制剂包括血红素(美国Thermo Fisher Scientific公司)、血红蛋白(美国Sigma-Aldrich公司)、靛蓝(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、腐殖酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA,美国 Sigma-Aldrich 公司)与钙离子(美国Sigma-Aldrich公司)。在含有0.5 ng DNA标准品 9948的 25 μL体系中,加入终浓度为 75~150 μmol/L 血红素、20~50 μmol/L 血红蛋白、14~20 mmol/L 靛蓝、100~175 ng/μL 腐殖酸、800~1600μmol/L EDTA与1~2.5mmol/L钙离子作为抑制剂,进行PCR产物检测,考察试剂盒对不同浓度抑制剂的耐受能力。

根据《法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求》(GA/T 815—2009)选用125pg的DNA标准品9948,按照上述复合扩增体系进行PCR扩增检验,扩增条件中循环次数分别选择26、28、29、30、32,并且平行重复检测 3 次。

1.4.3 stutter比例验证

对652份案件样本检测结果进行分析,统计六色荧光标记 miniSTR系统和AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒每个基因座的stutter峰高比例,并计算标准差(standard deviation,SD)。

1.4.4 DNA提取方法与案件检材适应性验证

对652份样本外的60份血迹、64份烟蒂、30份精斑、10份肋软骨、80份接触性棉签擦拭子采用不同方法提取DNA并定量,进行扩增检测。

分别采用Chelex-100法、磁珠法、硅珠法提取样本DNA进行上述复合扩增检验,根据分型结果比较不同提取方法对分型结果的影响。

1.4.5 降解检材检验能力验证

取实验室陈旧降解血液样本1份(AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒检测分型不完整)使用磁珠法提取DNA、DNaseⅠ(日本TaKaRa公司)处理标准品1份(1 ng标准品9948中加入0.1 U DNaseⅠ酶,15℃反应2 h),使用该六色荧光标记miniSTR系统进行检测。

2 结 果

2.1 分型一致、种属特异性及稳定性验证

652份实际案件样本的DNA提取产物,使用本次研究的六色荧光标记miniSTR系统、AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒和YfilerTMPlus PCR扩增试剂盒进行平行检验,有效DNA检验STR分型结果一致。

对狗、猪、牛、羊、鼠、猫、兔和大肠杆菌等生物检材的DNA进行检测,在分型范围内,均没有出现特异的DNA分型。

对六色荧光标记miniSTR系统中的主要组分进行稳定性测试,试剂经过反复冻融和复合扩增检验,采用标准品9948检测,结果显示,STR分型完整,图谱分布均衡。反复冻融20次仍能获得完整的STR分型。

2.2 灵敏度、混合样本、抗抑制能力及扩增循环次数验证

取总模板量 500、250、125、50、30 pg 的 DNA 标准品9948,使用本研究的复合扩增试剂进行检验,扩增条件中的循环次数分别为29和30次循环,根据分型结果统计基因座的检出率。统计结果发现,总模板量为30pg的DNA标准品9948,循环29次,漏检4个基因座,循环30次,漏检2个基因座。而总模板量为50pg及以上的DNA标准品9948均能获得完整STR分型。因此,本研究的六色miniSTR的检测灵敏度为50pg DNA。

混合样本DNA检验结果显示,分型分布与两者在混合物中的浓度比例相关(图1)。混合物浓度比例相近(在5∶1和1∶5之间),两者的STR分型分布均衡,90%以上的次要基因座能够得到有效分型。随着混合物比例差异的增加,次要成分的STR分型分布出现下降,当混合物浓度比例达到19∶1和1∶19时,浓度低的样本STR基因座分布仅约53%。

图1 标准品9947A与9948不同混合比例下的次要成分基因座平均检出率

1~11 分别代表 9947A 与 9948 的混合比例为 19∶1、9∶1、5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5、1∶9、1∶19

当血红素浓度不大于125μmol/L,各基因座均可获得有效扩增;血红蛋白在40 μmol/L以内,对试剂盒扩增没有影响;靛蓝浓度在16 mmol/L以内,对试剂盒扩增没有影响;腐殖酸浓度不高于150 ng/μL时,各基因座均可获得有效扩增;EDTA浓度不高于1200μmol/L时,各基因座均可有效扩增;钙离子浓度不高于2mmol/L时,各基因座均可有效扩增。

125pg的DNA标准品9948的STR分型的荧光信号与扩增循环次数成正相关。当循环28次以上时,标准品9948的STR分型完整,分布均匀,产物扩增峰值随着扩增循环次数增加,位于500~30 000 RFU,但是循环32次的扩增信号过强,出现荧光渗透峰。当循环26次,标准品9948的STR分型结果出现部分基因座的丢失,因此,根据反复的复合扩增测试,推荐使用循环29次进行案件样本的检测。若样本浓度高于500pg可以相应减少循环数,反之亦然,但不要超过31个循环,避免加重PCR的随机扩增效应。

2.3 stutter峰高比例验证

采用六色荧光标记miniSTR系统及AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒平行扩增652份案件样本,并对stutter峰高比例进行统计分析,两个试剂盒中每个基因座的stutter峰高比例平均百分比均在12%以下,且stutter峰高比例高或低的基因座,在两个试剂盒间不存在明显差异性(表3)。

表3 各基因座stutter峰高比例平均百分比 (n=652)

注:“-”表示此试剂盒中无此基因座

基因座 AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒平均stutter比例/% SD值 平均stutter比例/% SD值D3S1358 10.00 0.83 10.81 2.44 D13S317 5.74 2.21 6.54 1.22 D7S820 6.54 1.56 6.18 1.98 D16S539 5.11 1.87 4.30 1.12 D2S1338 10.44 1.50 8.54 2.10 TH01 3.31 0.66 3.94 1.73 D18S51 10.97 1.10 11.72 3.90 TPOX 4.39 0.70 3.39 0.74 vWA 7.55 3.04 3.99 2.91 D21S11 7.78 1.39 9.27 2.06 DYS391 9.79 2.01 - -D8S1179 6.64 1.86 5.66 0.80 D5S818 6.27 1.01 5.04 1.39 CSF1PO 6.25 1.54 4.64 1.61 D19S433 7.79 1.15 6.69 1.13 FGA 10.34 1.11 8.39 3.00六色荧光标记miniSTR系统

2.4 实际案件样本检测与检材适应性验证

本研究中的常规检材(血迹、烟蒂、精斑、肋软骨)检出率,采用六色荧光标记miniSTR系统和AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒均为93.73%(269/287),脱落细胞的检出率采用六色荧光标记 miniSTR系统和 AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒分别为26.03%(95/365)和25.75%(94/365)。选取另外60份血迹样本、64份烟蒂样本、30份精斑、10份肋软骨、80份接触性棉签擦拭子分别使用3种DNA提取方法(Chelex-100法、磁珠法、硅珠法)进行DNA提取及六色荧光标记miniSTR系统复合扩增检验,STR分型结果完整,峰值分布均衡。

2.5 降解检材检验能力验证

实验室陈旧降解血液样本和DNaseⅠ处理的标准品经六色荧光标记miniSTR系统检测,均获得完整分型。

3 讨 论

商业化STR试剂盒在扩增降解、含高抑制剂的样本时,大片段扩增效率会明显下降甚至丢失,缩短扩增片段长度可以提高降解检材和含高抑制剂检材的检出率。本研究的检测系统在靠近STR基因座核心重复区设计引物减小扩增子片段长度,将15个常染色体STR基因座、1个Amelogenin基因座和1个DYS391基因座合理排布于300bp(包含了FGA国外人群稀有等位基因42.2~50.2,最长的50.2可达307.8bp以内。引物设计时,避免由于引物3′端序列同源性较高而导致错误。同时考虑引物在不同检材扩增的适用性,保证不同检材扩增时,扩增效率都要满足试剂盒均衡性要求。通过对陈旧降解样本和DNaseⅠ处理标准品检测,六色荧光标记的16个miniSTR可以有效获得完整分型,适用于降解样本检测。与AmpFℓSTR®miniFilerTMPCR扩增试剂盒(美国AB公司)不同,本检测系统的miniSTR基因座包含AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒全部的基因座,与数据库兼容性高,且扩增子小于300bp。另外,在检测系统中新增DYS391基因座,可以在Y等位基因缺失的情况下辅助提供性别信息。针对PCR扩增的抑制剂,筛选高性能的PCR缓冲系统,优化热循环参数,显著提高了体系扩增性能。本研究采用新型的能量转移染料、优化的PCR缓冲体系、以miniSTR理念设计的更小的扩增子,改善了在降解、微量样本中容易出现大片段丢失的情况。同时,合理的位点排布也避免了类似的miniSTR检测系统(如AmpFℓSTR®miniFilerTMPCR扩增试剂盒)仅作为补充试剂盒的作用,本系统可以应用于案件现场样本检测和建库样本检测。经过性能评价实验,六色荧光标记的16个miniSTR试剂盒具有较高的检测灵敏度、抗抑制剂能力强、特异性好、扩增系统试剂组分稳定,适用于混合样本等特殊检材的DNA检验分型。对实际案件样本的检出率达到甚至超过 AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒的水平,可用于实际案件检验,为法庭科学DNA分析提供一种新方法。

参考文献:

[1] 郑秀芬.法医DNA分析[M].北京:中国人民公安大学出版社,2002.

[2] 李生斌,阎春霞,赖江华,等.DNA鉴定技术在法科学中的应用[J].遗传,2001,23(2):157-160.

[3] 李生斌,赖江华,高树辉,等.中国五个民族STR位点遗传多态性(2)[J].遗传学报,2000,27(12):1035-1041.

[4]ALAEDDINI R,WALSH S J,ABBAS A.Forensic implications of genetic analyses from degraded DNA--a review[J].Forensic Sci Int Genet,2010,4(3):148-157.

[5] COBLE M D.Capillary electrophoresis of miniSTR markers to genotype highly degraded DNA samples[J].Methods Mol Biol,2012,830:31-42.

[6]WANG H D,RUAN J G,SHEN C M,et al.Polymorphic distribution and forensic effectiveness study of eight miniSTR in Chinese Uyghur ethnic group[J].Mol Biol Rep,2014,41(4):2371-2375.

[7] 徐国昌,刘暖,张玥,等.Minifiler基因座对陈旧骨检测效果及在南阳回族人群中的多态性分布[J].南阳理工学院学报,2015,7(2):111-115.

[8] 王惠,白小刚,夏昱,等.4个Y-miniSTR基因座荧光标记复合扩增体系的建立[J].川北医学院学报,2015(1):6-10.

[9]BUTLER J M,SHEN Y,MCCORD B R.The development of reduced size STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA[J].J Forensic Sci,2003,48(5):1054-1064.

[10]ODRIOZOLA A,AZNAR J M,CELORRIO D,et al.Recent advances and considerations for the future in forensic analysis of degraded DNA by autosomic miniSTR multiplex genotyping[J].Recent Pat DNA Gene Seq,2011,5(2):110-116.

[11]BUTLER J M.Forensic DNA typing: biology,technology,and genetics of STR markers[M].2nd ed.Burlinton: Academic Press,2005.

Application of miniSTR Loci and Its Detection System for Degraded Materials in Forensic Medicine

WANG Xin1,CHEN Wei-zhong1,ZHANG Jian1,LI Jing-hui1,SUN Yuan-peng1,SHI Yun-jie1,ZHANG Lei2,CHEN Lin-li2,ZHOU Xiang2,ZHOU Ru-hua1
(1.Institute of Forensic Science,Suzhou Public Security Bureau,Suzhou 215131,Jiangsu Province,China;2.AGCU ScienTech Incorporation,Wuxi 214174,Jiangsu Province,China)

Abstract:ObjectiveTo establish multiplex system of 16 miniSTR loci,and explore its application value for the degraded materials in forensic medicine.MethodsThe multiplex system of 16 miniSTR loci was established using a six-dye fluorescence labeling technology and its application value in forensic medicine was assessed.ResultsA six-dye fluorescence labeling miniSTR amplification kit was developed,which enabled 15 autosomal STR loci,Amelogenin locus and DYS391 to be typed simultaneously.This method showed good specificity and could provide stable and accurate typing results with a sensitivity of 50 pg.This system also provided a good test result for the normal biological sample of actual cases.ConclusionThe multiplex system of 16 miniSTR loci has application value for degraded and trace materials with the advantages of high sensitivity and database compatibility,which can be used for forensic casework.

Keywords:forensic genetics;short tandem repeat;degraded DNA;low-level DNA;multiplex kits

通信作者周如华,男,副主任法医师,主要从事法医物证学检验;E-mail:13961329595@139.com

作者简介:王鑫(1986—),男,主检法医师,主要从事法医物证学检验;E-mail:wangxin5552137@163.com

基金项目:苏州市科学技术局产业技术创新专项(民生科技)资助项目(SS201526)

文章编号:1004-5619(2018)05-0532-06

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2018.05.019

文献标志码:A

中图分类号:DF795.2

收稿日期:2017-01-04)

(本文编辑:张素华)