酒精滥用与依赖是一个世界性的普遍现象，据世界卫生组织统计，全球酒精依赖者约1.4亿，还有4亿多人过度饮酒造成事故、损伤、疾病和死亡^[1]，每年有约330万人死亡（占所有死亡人数的5.9%）是由饮酒引起的^[2]。在我国，酒精滥用情况也非常严重，嗜酒或酒精依赖性人群达2亿左右^[3]，酒精依赖现象的显著增加使其在精神类疾病中排第三位^[4]。因此，需要一种客观有效的方法来评估个人的饮酒行为。

目前用于指示饮酒状况与酒精滥用的标志物包括血液中的糖缺陷转铁蛋白（carbohydrate-deficient transferrin，CDT）、平均红细胞体积（mean corpuscular volume，MCV）、γ-谷氨酰转移酶（glutamase transferase，GGT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT），血清和尿液中的乙基葡萄糖醛酸苷（ethyl glucuronide，EtG）和硫酸乙酯（ethyl sulfate， EtS）^[5]，头发中的EtG和脂肪酸乙酯（fatty acid ethyl ester，FAEE）^[6]，其中，国际广泛认可的是将EtG和CDT分别作为酒精依赖的标志物。而使用这些生物标志物检测乙醇摄入量可能造成假阳性或假阴性干扰，如肥胖、乙肝、丙肝、糖尿病、非酒精相关性脂肪肝和肝毒性药物（包括对乙酰氨基酚和抗生素，如阿莫西林）可导致GGT升高，MCV和CDT可受到年龄、性别和非酒精相关疾病的影响，并且CDT的检测时限仅为2周左右^[7]。EtG和EtS是很有前景的直接乙醇生物标志物^[8-10]，但其水平受急性肾损伤的影响^[11]。若毛发经过烫染、漂白或使用含EtG的发胶或发乳，毛发EtG阴性和阳性结果则较难解释^[12-13]；尿液EtG检测结果也可能受到尿液标本中特殊菌群的影响^[14]。尿液EtS检测的反应模式与EtG相似，但其与EtG相比几乎没有实际优势^[15-16]。

乙醇存在下细胞膜中磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）发生转磷酸基化反应，在磷脂酶D（phospholipase D，PLD）的催化下缓慢形成一组异常磷脂^[17-18]，统称为磷脂酰乙醇（phosphatidylethanol，PEth），是乙醇进入人体后的微量直接代谢物之一。到目前为止，已鉴定出48种PEth的同源物^[19]，其中PEth-16：0/18：1[即含有一个棕榈酸（16个碳原子和0个双键）和一个油酸（18个碳原子和1个双键）]是作为酒精生物标志物的单一最敏感分子形式，含量也最丰富，在轻度至中度饮酒者中占36%，在重度饮酒者中占总PEth的46%^[19-23]，其化学结构见图1。由于PEth只有在乙醇进入体内经过肝代谢的情况下才能产生，因此，理论上利用血液中PEth来诊断酗酒的特异性为100%^[24]，也有文献^[25]报道了PEth形成的特异性，年龄、性别和肝疾病并不影响酒精摄入和PEth之间的关系^[26]。国外学者开发了多种PEth的检测方法，如薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）^[27]、高效液相-蒸发光散射法（high performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector，HPLC-ELSD）^[28]、紫外（ultra-violet ray，UV）检测的毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）^[29]、基于单克隆抗体的免疫测定法^[30]、酶联免疫吸附试验法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）^[31]，以及近年来的液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）^[18]、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）^[21,32-33]等，但上述方法所需血样检材较多（150~200 μL），进样量较大（5~10 μL），检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）均较高（0.03 μmol/L），无法检测到较低浓度的PEth，从而无法对少量饮酒行为作出准确判断。

因此，本研究选择PEth同系物中含量最丰富的PEth-16：0/18：1作为研究对象以反映总PEth的含量，通过优化样品制备和质谱检测模式参数，改进全血中PEth-16：0/18：1的检测方法，使之能够对血中低浓度的PEth进行准确定性定量检测。

TSQ Fortis^TM三重四极杆质谱仪、Trace^TM 1310 GC分析仪、TriPlus^TM 500 GC顶空自动进样器（美国Thermo Fisher Scientific公司），Hypersil GOLD^TM色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm；美国Thermo Fisher Scientific公司），ACQUITY UPLC^® BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司），SQP型电子天平（德国sartorius公司），SC200-2氮气吹扫仪（杭州茂丰仪器有限公司），HP-01无油隔膜真空泵、LC-CQ-24F固相萃取仪（上海力辰邦西仪器科技有限公司），H1850台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），YJT-200-I托盘天平（常熟市天量仪器有限责任公司），KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），VORTEX-1涡旋混匀仪（德国IKA公司），FiveEasy^TM FE28-Standard pH计（瑞士METTLER TOLEDO公司），Bond Elut Certify小柱（130 mg，3 mL，美国Agilent公司）。

PEth-16：0/18：1标准品1 mg/mL（美国Cerilliant公司），乙醇标准溶液1 mg/mL（北京北方伟业计量技术研究院），甲醇（HPLC级，美国Thermo Fisher Scientific公司），乙腈（MS级，德国Merck公司），异丙醇（HPLC级，美国Thermo Fisher Scientific公司），甲酸、甲醇、异丙醇、氨水、二氯甲烷、丙酮等均为分析纯，乙酸铵为色谱纯。

标准物质溶液：本研究所采用的标准物质溶液质量浓度为1 mg/mL，根据稀释溶剂的要求，用甲醇稀释标准品母液，分别配制100 μg/mL的标准品储备液和10 μg/mL的标准品中间液。后续再根据实验需要用甲醇稀释PEth标准品的中间溶液得到标准工作溶液再使用。以上标准品溶液的容量瓶用封口膜密封后，置于-70 ℃冰箱中保存，使用时取出室温放置1 h后再配制。

固相萃取（solid phase extraction，SPE）洗脱液：精确量取8 mL二氯甲烷和2 mL异丙醇振荡混匀，再添加200 μL氨水于混合液中，充分振荡混匀即配制得到V_二氯甲烷∶V_异丙醇=8∶2（含2%氨水）洗脱液，置于棕色细口瓶中保存。

本研究比较了不同pH值条件下（pH值3.20、6.80、9.18）和不同有机溶剂（甲醇、乙腈、丙酮）对PEth提取回收率的影响，最终优化出操作简便、回收率高和基质干扰小的血液中PEth的前处理方法。即精确量取100 μL抗凝的静脉全血，加入500 μL 1%甲酸水溶液，充分涡旋振荡混匀后，加入2 mL丙酮，充分沉淀蛋白，在涡旋振荡器上涡旋2 min后，以8 000×g离心10 min，取上清液过Bond Elut Certify小柱进行SPE：（1）Bond Elut Certify小柱活化。向Bond Elut Certify小柱中依次加入甲醇和超纯水。（2）Bond Elut Certify小柱填充样品。将前述离心后的上清液缓慢加入小柱中使其自然流干，此过程中切勿加压。（3）Bond Elut Certify小柱清洗。上清液流尽后加入超纯水洗涤小柱，用真空泵加压，最大压力下抽干10 min。（4）洗脱液萃取。向完全抽干的Bond Elut Certify小柱中添加2 mL V_二氯甲烷∶V_异丙醇=8∶2（含2%氨水）洗脱液，将目标物收集于安瓿瓶中。最后，将装有目标物的安瓿瓶置于氮气流下40 ℃加热吹干，用100 μL V_乙腈∶V_异丙醇=1∶1的混合液复溶后进TSQ Fortis^TM三重四极杆质谱仪检测，进样量为1 μL。

对比当柱温为室温时ACQUITY UPLC^® BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Hypersil GOLD^TM 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）对目标物PEth的保留效果。

流动相分为3组：第一组A相为甲醇，B相为水；第二组A相为V_乙腈∶V_异丙醇=4∶1（含2% 500 mmol/L乙酸铵），B相为10 mmol/L乙酸铵水溶液；第三组A相为V_乙腈∶V_异丙醇=4∶1（含2% 500 mmol/L乙酸铵水溶液），B相为V_乙腈∶V_异丙醇∶V_水=1∶3∶1（含2% 500 mmol/L乙酸铵水溶液）。每组的B相分别设置酸性（pH=3.20）、近中性（pH=6.80）和碱性（pH=9.35）3种条件，流速均为0.35 mL/min，比较他们的洗脱效果。

对比等度洗脱和梯度洗脱对分析结果的影响，洗脱程序见表1。进样量为1 μL。

热电喷雾离子源（hearted electrospray ionization，HESI）选择ESI^-作为电离模式，静态喷雾电压3 200 V，鞘气40 Arb，辅助气15 Arb，离子传输管温度320 ℃，雾化温度400 ℃，透镜电压134 V，循环时间0.8 s，质量轴Q1分辨率0.7，Q3分辨率1.2，源后裂解电压5 V，采用选择反应监测（selected reaction monitoring，SRM）模式检测，先确定目标物的母离子，再进行二级质谱扫描选择监测的子离子碎片，通过优化电压与辅助气流速以及碰撞能量等参数，再按照离子丰度比由高到低原则选择两个碎片作为子离子（其中响应强度最高作为定量离子）。

准备3组空白血样，每组8份，分别添加对应的乙醇标准溶液使血液中乙醇质量浓度为0.05~0.7 mg/mL，3组添加样本分别置于室温（24 ℃）、4 ℃冰箱和-20 ℃冰箱中，在不同温度条件下各保存5 d后，按照前述仪器方法检测PEth含量，用Trace^TM 1310 GC分析仪和TriPlus^TM 500 GC顶空自动进样器检测乙醇含量，考察体外添加乙醇是否会产生PEth-16：0/18：1。

取10份不同来源的健康人静脉空白全血各100 μL，将上述样本按照1.3节方法处理，再按1.4节条件进样检测，考察可能出现的干扰峰，进行方法的专属性考察，要求血液空白基质中的内源性物质对待测物的检测没有干扰。

取健康人空白全血100 μL于15 mL具塞离心管中，加入PEth-16：0/18：1标准品工作溶液制备0.2、0.5、1、2、5、10、20、40、160 ng/mL，每个质量浓度平行检测3次。按照1.3节方法处理样品，再按1.4节条件进样检测，以待测物浓度（ng/mL）为横坐标，待测物峰面积为纵坐标作图，绘制标准曲线，运用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程和线性范围。以信噪比（S/N）≥3时的样品最低浓度为LOD，以信噪比（S/N）≥10时的样品最低浓度为LOQ。

基质效应是指生物样本基质中的共同提取干扰物影响目标物的离子化，从而使目标物在仪器上的响应强度发生改变（增强或者抑制）。因此需要对目标化合物在不同基质中的基质效应进行评价，并根据考察结果选择合适的分析方法消除产生的基质效应^[34]。准备不同基质来源的空白全血按照前述方法处理后，再添加相应质量浓度的PEth-16：0/18：1标准品溶液配制质量浓度为10、40和160 ng/mL的样本，各5份。进样仪器检测记录色谱峰面积S_A，再测定同样浓度的标准品溶液记录色谱峰面积S_B，以峰面积比值S_A/S_B（%）评价基质效应。

取空白全血，添加相应质量浓度的PEth-16：0/18：1标准品配制成低、中、高不同浓度的血液的待测样本（10、40、160 ng/mL）各5份，按照前述方法处理样本并进样检测。根据绘制的标准曲线计算加标样品的实测浓度，以待测样本的实测浓度与添加浓度之比计算方法学回收率；根据法医毒物分析方法验证通则^[35]计算测定的平均值和参考值的差值与参考值的百分比，即偏倚作为准确度，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）作为精密度。

取空白血样分别添加PEth-16：0/18：1标准品制备10、40和160 ng/mL的加标样本各5份，按照前述方法处理样本并进样仪器检测，每个样本连续进样3次取平均值；1 d内平行测定3次，记录色谱峰面积计算其相对标准偏差，得出日内精密度；连续3 d每天测定1次，记录色谱峰面积计算其相对标准偏差，得出日间精密度。

对宁德市公安局刑事侦查支队提供的3例酒驾肇事血液样本分别用顶空气相色谱法和UPLC-MS/MS法对血液中乙醇和PEth-16：0/18：1进行定量检测，以验证本研究所建立检测方法的可行性。

本研究对比了色谱柱ACQUITY UPLC^® BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Hypersil GOLD^TM 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）对目标物PEth的保留效果。由于Hypersil GOLD^TM 色谱柱对于PEth-16：0/18：1的保留效果更好，色谱响应强度更高，因此，本研究选择Hypersil GOLD^TM色谱柱作为分析用色谱柱。

3组不同流动相的研究结果表明：第三组B相近中性（pH=6.80）条件下对于PEth-16：0/18：1的保留与洗脱效果更好、响应值更高、色谱峰型好、基质干扰小，最终选择这一流动相条件用于PEth-16：0/18：1的分析。

等度洗脱和梯度洗脱对分析结果的影响研究表明，梯度洗脱优于等度洗脱，且在初始流动相比例为A∶B=30%∶70%时色谱响应值更高且峰型更好，因此，选择这一梯度洗脱程序作为液相色谱条件。

对仪器不同参数调整，通过改变静态喷雾电压、透镜电压及源后裂解电压、鞘气与辅助气流大小、离子传输管温度与雾化温度以及质量轴分辨率等质谱条件，最终优化选择702.1→255.20（碰撞能量为32.38 V）和702.1→281.27（碰撞能量为30.65 V）作为定性离子对，并选择702.1→281.27作为定量离子。PEth-16：0/18：1的SRM扫描质谱图见图2。

本研究比较了不同pH值（pH值3.20、6.80、9.35）和不同有机溶剂（甲醇、乙腈、丙酮）对PEth提取回收率的影响。结果表明，全血在不同pH值条件下经甲醇沉淀蛋白后再通过Bond Elut Certify小柱SPE后的回收率在3%~31%；不同pH值条件下经乙腈沉淀蛋白后再通过Bond Elut Certify小柱SPE后的回收率在11%~35%；不同pH值条件下经丙酮沉淀蛋白后再通过Bond Elut Certify小柱SPE后的回收率为9%~95%，其中在pH值3.20条件下利用丙酮沉淀蛋白后再进行SPE的提取回收率最高（95%）。分析可能是由于甲醇和乙腈有较强的极性，在沉淀蛋白的过程中会迅速结块成团导致目标物提取不充分故使提取回收率较低，因此本研究最终选择pH值3.20条件下使用丙酮沉淀蛋白，再经过Bond Elut Certify小柱富集纯化作为血液样本的前处理方法。

在体外添加乙醇的实验中，添加不同浓度乙醇的血样在3种条件下保存5 d后检测，血液乙醇浓度略有变化，质量浓度均在0.03~0.67 mg/mL，但在3组血样中均未检出PEth-16：0/18：1，证实了PEth需在乙醇进入人体后代谢的特殊条件下产生，而血液外源性暴露于乙醇不会造成假阳性干扰。

10份不同来源的空白全血样本经过前处理，血液中的内源性物质不会对目标物的检测造成干扰，表明该方法的专属性良好。由图3可见，空白血样中在目标峰处无干扰杂峰。

PEth-16：0/18：1在1~160 ng/mL质量浓度范围内与色谱响应值之间具有良好的线性关系，全血中加标后的线性方程为y=320.39x+856.82，相关系数为0.999 9，LOD为0.2 ng/mL，LOQ为1 ng/mL。

结果表明，目标物PEth在10、40、160 ng/mL质量浓度时的基质效应为91.00%~99.55%，满足《中华人民共和国药典》中体内样品分析基质效应在80%~120%的要求^[36]，表明本方法处理后的基质对目标物的测定无明显影响。

该方法的回收率在97.43%~103.61%，方法的准确度在0.99%~1.77%，均达到体内样本的分析要求。

研究结果显示，PEth在10、40和160 ng/mL的加标样本中日内精密度在0.4%~2.4%，日间精密度在1.1%~3.3%，日内和日间精密度均<10%，能满足体内样本的分析要求。

在宁德市公安局刑事侦查支队提供的3例酒驾肇事案件当事人血液样本中，用顶空气相色谱法添加内标叔丁醇后对乙醇进行定量检测，3份血液样本中检出乙醇的质量浓度分别为1.52、0.57和1.69 mg/mL。用本研究建立并优化的UPLC-MS/MS法检测乙醇代谢物PEth-16：0/18：1，其对应的质量浓度分别为195.49、83.67和876.12 ng/mL。该结果表明，对于实际的酒驾案件，在检测到乙醇的同时也检测出PEth且浓度较高，验证了检测方法的可行性。

本研究通过对比目标物PEth-16：0/18：1提取的不同pH值条件、不同有机溶剂的提取效率优化了血液中PEth的前处理提取方法，并通过对比不同流动相类型、pH值、梯度、质谱参数等条件优化了仪器方法，最终建立了血液中PEth-16：0/18：1的UPLC-MS/MS检测方法，可对血中PEth进行定性定量检测，LOD和LOQ分别为0.2 ng/mL和1 ng/mL。该方法简便快速、特异性强、灵敏度高、准确性好、线性范围宽。总体而言，血液中PEth的检测有望为酒精摄入状况和水平提供科学依据，并在所涉交通事故、酗酒肇事、职业卫生等案（事）件中发挥作用，以期为法医学鉴定中因酒后肇事案件逃逸后的饮酒行为认定、尸体检材中乙醇的来源确定、临床检验中酒精依赖者戒酒状况的评估等提供参考。