法医学杂志

法医学杂志, 2022, 38(4): 468-472 DOI: 10.12116/j.issn.1004-5619.2020.400907

论著

大鼠Gpnmb基因表达线性回归模型在损伤时间推断中的应用

郗延如,, 刘元新, 冯娜, 谷祯, 孙俊红, 曹洁, 靳茜茜, 杜秋香,

山西医科大学法医学院，山西 太原 030001

Application of Linear Regression Model of Gpnmb Gene in Rat Injury Time Estimation

XI Yan-ru,, LIU Yuan-xin, FENG Na, GU Zhen, SUN Jun-hong, CAO Jie, JIN Qian-qian, DU Qiu-xiang,

School of Forensic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

通讯作者: 杜秋香，女，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事法医病理损伤时间推断研究；E-mail：dqx_2008@126.com

编委: 黄平

收稿日期: 2020-09-15  

基金资助: 国家自然科学基金青年基金资助项目.  81901924
山西省优秀青年基金资助项目.  201901D211351

Received: 2020-09-15  

作者简介 About authors

郗延如（1994—），女，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：1463784484@qq.com

摘要

目的 探讨非转移性黑色素瘤糖蛋白B（glycoprotein non-metastatic melanoma protein B，Gpnmb） mRNA表达受损伤时间、死亡时间及死后保存温度的影响，建立Gpnmb mRNA表达与损伤时间的线性回归模型，为损伤时间推断提供潜在指标。 方法 将SD大鼠麻醉后钝性挫伤，随机分为损伤后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h组，每组18只，大鼠颈椎脱臼处死后各取6只分别保存在0 ℃、16 ℃、26 ℃中，在同一温度下于死后0 h、12 h、24 h重复收集大鼠后肢股四头肌损伤处肌肉组织样本，验证组大鼠分组与处理方式同上。使用RT-qPCR技术检测大鼠骨骼肌Gpnmb mRNA的表达。使用Pearson相关系数评价Gpnmb mRNA表达与损伤时间、死亡时间、死后保存温度的相关性，SPSS 25.0软件构建线性回归模型，验证组数据用于回代检验。 结果 Gpnmb mRNA的表达随损伤时间延长而持续增加，表达量与损伤时间高度相关（P<0.05），与死亡时间和死后保存温度基本不相关（P>0.05）。损伤时间（y）与Gpnmb mRNA相对表达量（x）的线性回归方程为y=0.611 x+4.489。回代检验结果证明该模型预测结果准确。 结论 Gpnmb mRNA的表达基本不受死亡时间及死后保存温度的干扰，而与损伤时间相关，因此可建立线性回归模型用于损伤时间推断。

关键词： 法医病理学 ; 损伤时间推断 ; 死亡时间 ; 死后保存温度 ; 非转移性黑色素瘤糖蛋白B ; 大鼠

Abstract

Objective To investigate the effects of injury time, postmortem interval （PMI） and postmortem storage temperature on mRNA expression of glycoprotein non-metastatic melanoma protein B （Gpnmb）, and to establish a linear regression model between Gpnmb mRNA expression and injury time, to provide aimed at providing potential indexes for injury time estimation. Methods Test group SD rats were anesthetized and subjected to blunt contusion and randomly divided into 0 h, 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 20 h and 24 h groups after injury, with 18 rats in each group. After cervical dislocation, 6 rats in each group were collected and stored at 0 ℃, 16 ℃ and 26 ℃, respectively. The muscle tissue samples of quadriceps femoris injury were collected at 0 h, 12 h and 24 h postmortem at the same temperature. The grouping method and treatment method of the rats in the validation group were the same as above. The expression of Gpnmb mRNA in rat skeletal muscle was detected by RT-qPCR. The Pearson correlation coefficient was used to evaluate the correlation between Gpnmb mRNA expression and injury time, PMI, and postmortem storage temperature. SPSS 25.0 software was used to construct a linear regression model, and the validation group data was used for the back-substitution test. Results The expression of Gpnmb mRNA continued to increase with the prolongation of injury time, and the expression level was highly correlated with injury time （P<0.05）, but had little correlation with PMI and postmortem storage temperature （P>0.05）. The linear regression equation between injury time （y） and Gpnmb mRNA relative expression （x） was y=0.611 x+4.489. The back-substitution test proved that the prediction of the model was accurate. Conclusion The expression of Gpnmb mRNA is almost not affected by the PMI and postmortem storage temperature, but is mainly related to the time of injury. Therefore, a linear regression model can be established to infer the time of injury.

Keywords： forensic pathology ; wound age estimation ; postmortem interval ; postmortem storage temperature ; glycoprotein non-metastatic melanoma protein B （Gpnmb） ; rats

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本文引用格式

郗延如, 刘元新, 冯娜, 谷祯, 孙俊红, 曹洁, 靳茜茜, 杜秋香. 大鼠Gpnmb基因表达线性回归模型在损伤时间推断中的应用. 法医学杂志[J], 2022, 38(4): 468-472 DOI:10.12116/j.issn.1004-5619.2020.400907

XI Yan-ru, LIU Yuan-xin, FENG Na, GU Zhen, SUN Jun-hong, CAO Jie, JIN Qian-qian, DU Qiu-xiang. Application of Linear Regression Model of Gpnmb Gene in Rat Injury Time Estimation. Journal of Forensic Medicine[J], 2022, 38(4): 468-472 DOI:10.12116/j.issn.1004-5619.2020.400907

损伤时间推断一直是法医学工作中的重点和难点。目前研究已证实，多种mRNA在损伤修复中呈时序性变化，可出现表达增强、表达降低或表达沉默的模式，不同mRNA表达的时间顺序和峰值也不相同[1-2]。机体死后，由于受到尸体保存温度、细胞内核酸酶活性变化等因素影响，部分mRNA的降解与死亡时间（postmortem interval，PMI）呈一定规律性，机体死后保存温度的升高也会加速mRNA降解[3-6]。由此，利用mRNA的表达推断损伤时间可能会受到死亡时间及尸体保存温度的影响。

本研究从高通量测序获得的差异基因中筛选出与炎症相关的非转移性黑色素瘤糖蛋白B（glycoprotein non-metastatic melanoma protein B，Gpnmb），有研究[7-8]结果表明，该基因参与组织损伤后的炎症反应和纤维化与损伤修复过程密切联系，在机体损伤后其表达升高。本研究拟采用实时定量反转录聚合酶链反应（reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技术检测不同损伤时间、死亡时间及死后保存温度下大鼠骨骼肌中Gpnmb mRNA的表达量，探究Gpnmb mRNA表达与损伤时间、死亡时间及死后保存温度的相关性，建立mRNA表达与损伤时间的线性回归模型，并在此基础上研究Gpnmb mRNA在损伤时间推断中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

TRIzol Reagent购自美国Invitrogen公司，PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）和Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）购自日本TaKaRa公司。

2-16PK型台式冷冻离心机购自德国Sigma公司，Infinite® 200 PRO Nano Quant检测仪购自瑞士TECAN公司，CFX384 TouchTM荧光定量PCR检测系统购自美国BIO-RAD公司。

1.2 大鼠骨骼肌挫伤模型的建立和检材提取

由山西医科大学实验动物中心提供健康雄性成年SD大鼠共147只，6~8周龄，体质量为200~230 g，其中126只为实验组，21只为验证组。将实验组大鼠随机分为损伤后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h组，每组18只，使用3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射（0.13 mL/100 g）麻醉大鼠，去除其右后肢股四头肌处毛发，将500 g重力锤从高30 cm处自由落体砸于大鼠右后肢股四头肌处[9]。将大鼠按设置的时间点颈椎脱臼处死，在0 ℃、16 ℃、26 ℃ 3个温度下各保存6只，于死后0 h、12 h、24 h重复收集肌肉样本（死后0 h仅取材于其中一个温度组）。每次取大鼠右后肢股四头肌损伤处肌肉组织100 mg置于液氮中，-80 ℃保存。验证组大鼠分组与处理方式同上，每个损伤组3只大鼠，死后分别保存在0 ℃、16 ℃、26 ℃下并连续取材。

本研究已通过山西医科大学的伦理审查（审批文号：2019LL095）。

1.3 总RNA提取与RT-qPCR检测

使用TRIzol Reagent提取总RNA，并使用Infinite® 200 PRO Nano Quant检测仪测量总RNA纯度及浓度，D260/D280在1.8~2.0可进行后续实验。将400 ng总RNA用PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）反转录为cDNA。

按照Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）试剂盒操作说明书配制反应混合液，使用CFX384 TouchTM荧光定量PCR检测系统进行qPCR。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 40 s，40个循环。反应体系为25 μL，包括：Taq DNA聚合酶12.5 μL，目的基因和内参基因的上下游引物及探针（各0.5 μL）共3组，去离子水4 μL，cDNA 4 μL。5倍浓度梯度稀释cDNA，将其作为模板进行qPCR，得到标准曲线，测量内参基因Rpl13、Rpl32及目的基因Gpnmb的扩增效率，扩增效率在90%~110%范围内、相关系数在0.980以上，可认为体系稳定、扩增良好，可用于后续实验。各组取4 μL cDNA样本分别加入反应体系，对内参基因和目的基因进行复合扩增，利用2-ΔΔCt法[2]得到Gpnmb mRNA的相对表达量。内参基因Rpl13、Rpl32[10]及目的基因Gpnmb的序列均来自GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），利用Allele ID 6.0软件（北京天演融智软件有限公司）进行引物及探针设计，经BLAST检索确认其特异性，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物及探针序列详见表1。

表1   引物及探针序列

Tab. 1  Sequences of primers and probes

基因基因ID1）引物和探针序列（5′→3′）产物长度/bp
Rpl13NM_031101.1

上游：TCGTGAGGTGCCCTACAGTTAG；

下游：GGTGCGTGCCATTTTCTTGTG；

探针：CACACCAAGGTCCGGGCTGGCAG

107
Rpl32NM_013226.2

上游：ATCTGGCCCTTGAATCTTCTCC；

下游：AGAGGACCAAGAAGTTCATCAGG；

探针：TGTCGATGCCTCTGGGTTTCCGCC

115
GpnmbNM_133298.1

上游：CATCGTCTGCCCCTGTGGTCCAGT；

下游：GGCAATATCGTCTATGAGAGGAAC；

探针：TGGTGTTGTCTTCCCAGTCC

91

注：1）基因ID源于GenBank。

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1.4 统计分析

利用SPSS 25.0软件进行数据分析，各组数据以x¯±s表示，对RT-qPCR测得的Gpnmb mRNA相对表达量进行单因素方差分析，多组间两两比较采用最小显著性差异（least significant difference，LSD）检验。使用Pearson相关系数分别评价mRNA相对表达量与损伤时间、死亡时间和死后保存温度的相关性。筛选相关因素后，建立线性回归模型并进行方差检验。将验证组数据代入拟合的回归方程计算损伤时间（预测值），将预测值与实际值进行配对样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 Gpnmb mRNA的提取及表达

所有样本均成功提取RNA，总RNA的D260/D280值在1.8~2.0。5倍浓度梯度稀释cDNA原液进行标准品制备，测得目的基因（Gpnmb）和内参基因（Rpl13、Rpl32）的扩增效率分别为107.4%、104.9%、104.2%，相关系数分别为0.996、0.996、0.999，可用于后续实验。

单因素方差分析结果显示：死亡时间组间差异无统计学意义（P>0.05）；死后保存温度组间差异无统计学意义（P>0.05）；损伤时间组间差异具有统计学意义（P<0.05），经LSD检验，各损伤组间差异均有统计学意义（P<0.05）。如表2所示，大鼠死后分别保存在0 ℃、16 ℃、26 ℃中0 h、12 h、24 h，Gpnmb mRNA在骨骼肌损伤后主要呈持续上调的表达模式。

表2   不同死亡时间、死后保存温度下Gpnmb mRNA随损伤时间的表达 (n=6，x¯±s)

Tab. 2  The expression of Gpnmb mRNA varied with the injury time at different time of death and postmortem storage temperature

组别死后0 h0 ℃16 ℃26 ℃
死后12 h死后24 h死后12 h死后24 h死后12 h死后24 h
损伤后0 h1.00±0.250.76±0.201.50±0.312.20±0.501.52±0.151.87±0.350.72±0.15
损伤后4 h1.97±0.462.76±0.681.58±0.182.21±0.361.79±0.422.31±0.417.02±2.08
损伤后8 h2.53±0.503.51±0.834.33±1.164.00±0.993.64±1.315.10±0.979.84±2.50
损伤后12 h9.20±1.2313.87±4.5116.75±3.327.98±1.8312.52±2.455.52±1.6912.49±3.47
损伤后16 h13.71±4.1416.57±5.4613.38±1.8018.33±5.1315.56±7.9021.37±8.3016.64±1.88
损伤后20 h15.48±6.2719.75±2.3125.71±9.4623.23±5.0316.91±6.8923.27±9.5329.57±11.61
损伤后24 h30.18±10.8221.52±2.8928.41±7.0733.54±2.3113.45±3.3732.02±3.1633.49±4.46

注：各损伤组间差异均有统计学意义（P<0.05）。

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2.2 相关性及线性回归模型的建立

损伤时间与Gpnmb mRNA相对表达量的Pearson相关系数为0.837，两变量间呈高度正相关（P<0.05）。死亡时间、死后保存温度与Gpnmb mRNA相对表达量的Pearson相关系数分别为0.055（P>0.05）、0.008（P>0.05），差异无统计学意义，可认为死亡时间、死后保存温度两变量与Gpnmb mRNA相对表达量基本不相关，可在模型中排除。

剔除死亡时间和死后保存温度这两个影响因素后，建立损伤时间（y）与Gpnmb mRNA相对表达量（x）的回归模型为y=0.611 x+4.489。该回归模型经方差检验具有统计学意义（R2=0.701，F=685.774，P<0.05）。

2.3 回代检验

将验证组数据代入拟合的回归方程，损伤时间预测值的均值与实际值最小相差0.63 h，最大相差4.82 h（图1）。配对样本t检验结果显示，损伤时间预测值和实际值之间差异无统计学意义（P>0.05），证明建立的回归模型具有较好的预测能力，可用于损伤时间推断。

图1

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图1   回代检验结果

Fig. 1   Results of back-substitution test


3 讨 论

机体损伤后局部的组织病理学、RNA含量、蛋白水平、炎症细胞等改变对推断损伤时间均具有重要价值[11-12]。目前研究发现，多种mRNA在机体损伤后呈时序性变化[2，13-14]，也有研究已证实机体死后多种mRNA在生物酶作用下降解速率不同，且尸体所处环境温度对降解速率影响很大[3，5，15-17]。由此可知，应用mRNA推断生前损伤时间可能受到死亡时间和死后保存温度影响。

研究[7-8，18-19]发现，Gpnmb基因在成骨细胞、树突状细胞和巨噬细胞等多种细胞中高度表达，是炎症的负调节因子，对损伤有保护作用。正常情况下，Gpnmb基因在机体内处于低水平表达；机体损伤后，Gpnmb的表达随着骨髓源性巨噬细胞的极化和溶酶体应激而增高，并通过IL-4/STAT6通路促进M2型巨噬细胞的极化，发挥抑制免疫细胞活化、清除病原体、释放抗感染物质、维持纤维化和纤溶平衡的作用[7-8，20]。因此，Gpnmb基因的表达与组织损伤修复过程联系紧密。由于Gpnmb表达在人类基因组及其他物种间具有同质性，研究该指标在动物模型中的表达规律及作用能够为人体损伤时间推断提供参考[21]。

本研究应用RT-qPCR技术探讨大鼠骨骼肌Gpnmb mRNA表达随损伤时间、死亡时间和死后保存温度的变化规律，通过Pearson相关系数评价死亡时间、死后保存温度和损伤时间对Gpnmb mRNA表达的影响。结果表明，Gpnmb mRNA表达与死亡时间和死后保存温度不相关。因此，利用Gpnmb mRNA推断损伤时间受到死亡时间或尸体保存温度等死后因素的影响较小或基本无影响。在此基础上进一步研究发现，Gpnmb mRNA在骨骼肌损伤后呈持续上调的表达模式，与损伤时间呈线性关系，建立的回归模型为y=0.611 x+4.489，方差齐。通过回代检验可知，外部验证预测值与实际值最小相差0.63 h，最大相差4.82 h，模型预测较准确。因此，从本实验结果来看，Gpnmb mRNA表达量与损伤时间有很强的正相关性，即随着损伤时间的延长，Gpnmb mRNA的表达也随之增高，并且在死后24 h内可以保持较高的稳定性，降解速率也几乎不受温度变化的影响。

已有研究证实，CAPN5、VEGFA、HAF等多种mRNA的表达随死亡时间呈规律性变化[17，22]；当温度升高时，CDC25B、ACTB、GAPDH等mRNA的稳定性降低，且随着死亡时间的延长明显降解[23-24]。但也有研究[23]报道，在不同温度影响下，Rpl27、Copb1、Rbfox1等mRNA在死后24 h内基本无变化，但这些研究均未考虑大鼠不同损伤时间对mRNA的影响。本研究对3种因素综合考虑，将不同损伤时间的大鼠处死后在0 ℃、16 ℃和26 ℃ 3个温度下保存24 h，发现Gpnmb mRNA的表达几乎不受死亡时间和死后保存温度的影响，而仅与损伤时间相关，这一点极其有利于生前损伤时间推断。该结果进一步提示科研工作者在后期筛选用于损伤时间推断的指标时，应尽量选取不受死亡时间和死后保存温度干扰的指标，从而简化损伤时间推断的问题。

本研究采用线性回归模型探索Gpnmb mRNA表达在损伤时间推断中的应用，但是此模型较简单，在数据信息的挖掘以及预测能力方面稍显不足。因此，在后续的损伤时间推断研究中，应使用多基因联合推断损伤时间，采用机器学习算法等建立更为可靠的指标评价体系，剔除其他对损伤时间推断影响较大的指标，筛查与损伤时间高度相关的mRNA指标，从而对损伤时间作出更为准确的预测。

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