深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）和肺血栓栓塞症统称为静脉血栓栓塞，具有发生率高、危害性大和致死率高等特点。创伤、外科手术、下肢骨折、肢体制动、长期卧床和自身疾病等因素均可诱发DVT，DVT脱落可继发肺血栓栓塞症而引起猝死^[1-4]。

DVT演变过程包括血栓的形成、溶解和机化。免疫细胞在血栓形成和溶解过程中发挥着重要作用，主要是中性粒细胞的募集和激活^[5-9]。在血栓形成过程中，缺氧可诱导血管内皮细胞释放血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）和P选择素，从而募集并激活中性粒细胞，使其释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap，NET），该过程被称为NETosis^[10-11]。NET不仅具有杀灭病原体的作用，还能促进血栓形成，其在静脉、动脉和癌症相关血栓中的含量均显著增高^[12-16]。具体过程为NET捕获血小板、红细胞和纤维蛋白原，并激活外源性和内源性凝血途径^[17-18]，继而促进血栓形成。

NETosis主要具有两种方式，即自杀型和活力型。自杀型通过Ras/Raf/MEK/ERK信号通路激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，产生活性氧使胞内钙离子浓度增加。钙离子通过激活细胞核内的肽酰基精氨酸脱亚氨酶4（peptidylarginine deiminase 4，PAD4）促进组蛋白瓜氨酸化和染色质解聚，继而核膜破裂，染色质释放至胞质，并进行蛋白质装饰，最终细胞膜破裂，释放NET并引发中性粒细胞死亡。活力型也发生PAD4的激活、组蛋白的瓜氨酸化和染色质的解聚，但不依赖于NADPH氧化酶的激活，而是以囊泡转运的方式将DNA和蛋白质的复合物释放至细胞外，并形成NET，但该过程不会导致中性粒细胞死亡^[19-22]。两种方式都涉及组蛋白的瓜氨酸化，因此，瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3，CitH3）被认为是NETosis的生物学标记物^[17，23-25]。

在静脉血栓栓塞致死案件中，确定DVT的形成时间有助于死因分析，从而鉴定创伤或医疗行为是否与静脉血栓栓塞有因果关系。然而，根据已建立的血栓组织学年龄分期标准只能粗略地评估血栓形成时间^[17，23-25]。因此，需要为血栓形成时间推断寻找更合适的参考指标，以缩小其推断误差。本研究拟建立小鼠下腔静脉（inferior vena cava，IVC）血栓发生模型，通过免疫组织化学染色、双重免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测CitH3在血栓发展过程中的表达及时序性变化，探讨其用于血栓形成时间推断的可行性。

将40只雄性正常ICR小鼠（10~12周龄，江苏华创信诺医药科技有限公司）随机分为建模后0 h以及1、3、5、7、10、14、21 d共8组，每组5只。每组小鼠予以异氟烷吸入麻醉（诱导麻醉浓度为2%~3%，维持麻醉浓度为1.5%~2%）后，沿着小鼠腹部中线切开腹壁，暴露并钝性分离IVC，在左肾静脉与IVC的汇合处正下方结扎IVC，建立淤血诱导的血栓发生模型^[26-27]。建模后0 h组小鼠在建模后立即通过异氟烷过量麻醉处死，在结扎点下方1 cm处截取淤血的IVC段。其余7组小鼠在左肾静脉结扎后逐层缝合腹膜和皮肤，碘伏消毒缝合创部位，待小鼠复苏后单只独立饲养，分别于建模后1、3、5、7、10、14、21 d通过异氟烷过量麻醉处死小鼠，再次开腹在结扎点下方1 cm处截取形成血栓的IVC段。在本研究中，建模后1~10 d组的小鼠均检见血栓形成。建模后14 d组和21 d组各有2只小鼠未检见血栓，用10~12周龄雄性ICR小鼠重新建模进行替换，确保建模后14 d组和21 d组各有5只小鼠的IVC血栓样本用于研究。

取材后，将各组的每份样本均分为两部分，一部分用于免疫组织化学染色和双重免疫荧光染色，另一部分用于蛋白质印迹法检测。

本研究已获得温州医科大学实验动物伦理委员会的审批（审批文号：2023-0261），符合《实验动物 福利伦理审查指南》（GB/T 35892—2018）的要求。

按常规将组织样本制作成4 μm厚的石蜡切片。将切片置于65 ℃隔水式恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）中烤制2 h，随后对切片进行脱蜡、脱苯、水化处理，使用兔二步法检测试剂盒（PV-9001；北京中杉金桥生物技术有限公司）中内源性过氧化物酶阻断剂灭活切片的内源性过氧化物酶，再将切片置于柠檬酸钠缓冲液（0.01 mol/L，pH=6.0；北京索莱宝科技有限公司）中加热修复抗原，待切片冷却后，在切片上滴加牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA；Fraction V，上海碧云天生物技术有限公司）室温封闭1 h，然后分别滴加山羊抗小鼠髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）多克隆抗体（5 μg/mL，美国Bio-Techne公司）、兔抗小鼠CitH3多克隆抗体（1∶1 000，美国Cell Signaling Technology公司），在保湿盒内4 ℃孵育过夜。复温后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤切片3次，分别滴加山羊二步法检测试剂盒（PV-9003；北京中杉金桥生物技术有限公司)中的增强酶标免抗山羊IgG聚合物和兔二步法检测试剂盒中的增强酶标山羊抗兔1gG聚合物，并放入保湿盒内，37 ℃孵育45 min。切片经PBS洗涤后，使用DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）进行显色，然后使用苏木素染色剂（G1140；北京索莱宝科技有限公司）复染细胞核。

使用共聚焦荧光显微镜（ECLIPSE 80i，日本Nikon公司）观察组织切片，建模后0 h组的切片分别在淤血中心区和周围区随机选择2个和3个高倍视野（×1 000），建模后1~21 d组的切片分别在血栓中心区和周围区随机选择2个和3个高倍视野（×1 000），人工统计5个视野内中性粒细胞（MPO阳性细胞）数量和CitH3阳性细胞数量，并计算CitH3阳性细胞数量与中性粒细胞数量的比值（the ratio of CitH3‑positive cells to neutrophils，C/N）。

为了鉴别表达CitH3的细胞类型，同时使用抗CitH3抗体和抗MPO抗体对切片进行双重免疫荧光染色。切片经脱蜡、水化、抗原修复和封闭后，滴加山羊抗小鼠MPO多克隆抗体和兔抗小鼠CitH3多克隆抗体（1∶1 000），然后将切片置入保湿盒内4 ℃孵育过夜。复温后用PBS洗涤切片3次，滴加DyLight 488标记的驴抗山羊IgG（1∶500，英国Abcam公司）和DyLight 594标记的驴抗兔IgG（1∶500，英国Abcam公司），放入保湿盒中，室温下孵育1 h。切片经PBS洗涤后，用Hoechst 33258染色液（上海碧云天生物技术有限公司）复染细胞核。然后使用水溶性封片剂封片，将切片置于全自动正置荧光显微镜（德国Leica公司）下观察。

将样本剪碎后置于1.5 mL微量离心管中，加入含有蛋白酶抑制剂和苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），在冰浴环境下进行组织匀浆。匀浆后将微量离心管插在冰上静置30 min，离心后提取上清液。用BCA法测定各样本上清液的蛋白浓度，然后将每个样本的上清液配制成相同蛋白浓度的样品。在每个上清液样品中加入5×蛋白上样缓冲液，混匀后置于金属浴100 ℃加热10 min，然后将样品置于-80 ℃保存备用。

使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法分离蛋白样品内不同分子量的蛋白质，分离胶的浓度为10%。电泳分离蛋白后，将蛋白转印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。使用TBST洗膜3次后，将PVDF膜转移至5%脱脂牛奶中封闭2 h。使用兔抗小鼠CitH3多克隆抗体（1∶1 000）或兔抗小鼠GAPDH多克隆抗体（1∶5 000，美国Proteintech公司）孵育PVDF膜，4 ℃过夜。TBST洗膜3次，使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技术有限公司）室温孵育PVDF膜2 h。TBST洗膜3次，使用增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）显影PVDF膜上的阳性条带。曝光成像后，用ImageJ软件（https://imagej.net/ij/）分析各条带的光密度值。以GAPDH为内参，检测各组CitH3蛋白的相对表达量。

所有数据采用均数±标准差（x¯±s）表示，使用SPSS 26.0软件（美国IBM公司）进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，事后比较采用最小显著差异法（least significant difference，LSD），检验水准α=0.05。

在IVC的血栓发展过程中，CitH3主要表达于多形核细胞。建模后0 h，在淤血的IVC内仅检见个别CitH3阳性的多形核细胞。与建模后0 h组相比，建模后1~7 d形成的血栓中CitH3阳性细胞数量增多，并在建模后5 d达到峰值。建模后1、3、5、7、10 d组的CitH3阳性细胞数量与相邻上组相比，差异均有统计学意义（P<0.05，表1，图1）。

考虑到CitH3是NETosis的生物学标记物，本研究使用抗MPO抗体检测血栓发展期间的中性粒细胞数量。结果显示，血栓发展期间募集的多形核细胞是表达MPO的中性粒细胞。建模后0 h，淤血的IVC内可见少量中性粒细胞。与建模后0 h组相比，中性粒细胞数量在建模后1~14 d形成的血栓中增多，并在建模后1 d达到峰值（表1、图1）。而且，各组中性粒细胞数量均多于CitH3阳性细胞数量。C/N值在建模后1 d开始升高，于建模后5 d达到峰值，此后减少（表1）。

此外，本研究同时使用抗CitH3抗体和抗MPO抗体进行双重免疫荧光染色，以鉴定CitH3表达的细胞类型。结果显示，在血栓发展期间CitH3主要表达于中性粒细胞（图2）。

蛋白质印迹法检测结果（图3）显示，与建模后0 h组相比，CitH3蛋白的相对表达量在建模后1~10 d组升高（P<0.05）。CitH3蛋白表达水平在建模后5 d达到峰值，此后下降。建模后1、3、5、7、10 d组的CitH3蛋白相对表达量与相邻上组相比，差异均有统计学意义（P<0.05，表2）。

血栓形成时间推断对于静脉血栓栓塞致死案件的法医学鉴定具有重要意义。在法医学实践中，IRNIGER和FINESCHI等建立了人类血栓的组织学年龄分期标准。根据IRNIGER^[28]提出的标准，血栓的组织学年龄可依次分为6个阶段：1~3 d、3~8 d、4~20 d、8 d~2个月、2~8个月、超过6~12个月。FINESCHI等^[29]更新了IRNIGER的标准，将血栓的组织学年龄分为3个阶段：1~7 d、2~8周、超过2个月。虽然IRNIGER和FINESCHI等建立的标准具有应用指导价值，但通过组织学特征评价血栓形成时间有较大的误差。

DVT演变过程包括血栓的形成、溶解和机化，免疫细胞在血栓的形成和溶解中发挥着重要作用^[5-7]。研究^{[17-18，30-31]}表明，中性粒细胞可以通过释放NET促进血栓形成并维持早期血栓的稳定性，同时释放趋化因子促进巨噬细胞募集到血栓。募集的巨噬细胞可以产生多种炎症因子和基质降解酶，并吞噬血栓内死亡的中性粒细胞和其他细胞碎片，从而调节血栓的溶解^[30-32]。NOSAKA等^[7]发现中性粒细胞和巨噬细胞的数量比值（the ratio of neutrophils to macrophage，N/M）在小鼠IVC血栓发展过程中呈现时序性变化，可以利用N/M值区分1 d和3 d的血栓形成时间。

本课题组前期通过建立淤血诱导的小鼠IVC血栓诱发模型，为血栓形成时间推断寻找新的参考指标，该模型的血栓体积在建模后逐渐变大，于建模后5 d达到峰值^[5]。本研究结果显示，NETosis标记物CitH3主要表达于血栓内的中性粒细胞，CitH3的阳性细胞数量及其蛋白表达水平在建模后1 d开始升高，于建模后5 d达到峰值，与血栓体积达到峰值的时间一致，提示NETosis可能促进了血栓形成。据文献^[19-22]报道，在NETosis过程中发生组蛋白瓜氨酸化，形成CitH3并导致染色质解聚，染色质进入胞质后被MPO和中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）等生物活性物质修饰，继而释放到胞外形成NET。也有研究^[13-16]表明，NET在静脉、动脉和癌症相关血栓中的含量增高。NET可以激活血小板、诱导内皮细胞表达组织因子，并能捕获血小板、红细胞、凝血因子Ⅻ、vWF和组织因子，从而促进血栓形成^[17-18，28]。本研究的发现与上述研究结果一致，表明NETosis能够促进血栓形成。

NETosis不仅能促进血栓形成^[17-18，28]，也可以作为中性粒细胞死亡的一种方式^[19-22]。本研究结果显示，建模后1~5 d血栓内的CitH3阳性细胞数量逐渐增多，而中性粒细胞数量逐渐减少，提示在血栓发展过程中部分中性粒细胞可能以NETosis的方式发生死亡。从法医学应用的角度考虑，观察CitH3的表达以及C/N值可以为血栓形成时间推断提供有用的参考信息。与本研究其他建模后时间组比较，CitH3的阳性细胞数量及其蛋白表达水平在建模后1~7 d增多（P<0.05），在建模后5 d达到峰值。CitH3阳性细胞数量大于20及CitH3蛋白相对表达量大于0.4，提示血栓形成时间为1~7 d；CitH3阳性细胞数量大于35及CitH3蛋白相对表达量大于0.65，进一步提示血栓形成时间为3~5 d；CitH3蛋白相对表达量大于0.85，提示血栓形成时间在第5天。建模后1、3、5、7、10 d组与相邻上组相比，CitH3阳性细胞数量及蛋白表达水平差异均有统计学意义（P<0.05），且C/N值在建模后5 d达到峰值（>75%），高于其他建模后时间组，虽然建模后1 d组和7 d组的CitH3阳性细胞数量及蛋白表达水平差异无统计学意义，但两组间的C/N值有差别（P<0.05）。本研究结果显示，同时观察CitH3表达及C/N值可以区分1、3、5、7以及≥10 d的血栓形成时间。NOSAKA等^[7]研究表明，N/M值可以用于鉴别1 d和3 d的血栓形成时间。与NOSAKA等^[7]的研究比较，观察CitH3表达及C/N值可进一步识别5 d和7 d的血栓形成时间。

本研究证实，在小鼠IVC血栓形成期间CitH3的表达上调并呈现时序性变化，观察CitH3表达及C/N值可为血栓形成时间的推断提供参考。然而，本研究具有一定的局限性。虽然CitH3是NETosis标记物，但与NE-DNA复合物、MPO-DNA复合物等NETosis标记物比较，CitH3只能特异识别PAD4介导的NETosis，而NETosis的启动是否必须依赖于PAD4的催化尚不明确^[19]。CitH3与其他NETosis标记物的表达模式是否有差异，在血栓发展期间NET形成相关蛋白（如PAD4、NE等）的变化趋势是否与CitH3的表达趋势一致，仍有待后续研究阐明。此外，人类的DVT可以由不同的因素引起，包括创伤、骨科手术、疾病、肢体制动等，本研究建立的小鼠DVT模型无法复制人类DVT的复杂情况。就血栓形成过程而言，人体DVT常始发于血管内皮细胞损伤或低血流状态，而本研究使用的淤血模型在建模时完全阻断了血流，模拟了在血流停滞时发生血栓的情况。针对人类DVT不同形成原因和过程，目前已经建立了不同的DVT动物模型，如低血流的IVC狭窄模型、IVC狭窄合并血管壁损伤模型、IVC血管内皮细胞电解损伤模型等^[33-34]。对于法医学实践应用，仍需要使用不同的DVT动物模型以及人体血栓样本，进一步验证CitH3表达规律用于血栓形成时间推断的普适性。