近年来，通过研究信使RNA（messenger RNA，mRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）和环状RNA（circular RNA，circRNA）等具有组织特异性和不同发育阶段表达特异性的生物学遗传标记，发现了RNA在法医物证学中独特的应用价值，如基于高通量测序技术和微阵列技术筛选具有特异性表达的基因，并结合实时荧光定量逆转录聚合酶链反应，分析体液斑的生物成分，进一步鉴定体液的组织来源^[1]；也可应用于年龄推断^[2]、死亡时间推断^[3]和损伤形成时间推断^[4]等方面。然而，RNA相关实验研究的结果与样本RNA的质量密切相关。

外周血是法医物证学日常检案及研究中较为常见的生物学检材。尽管高质量的RNA可通过立即从新鲜外周血中抽提得到，但在实际检案中，外周血样本多不具备立即抽提的条件。因此，如何保存外周血样本从而获得高质量的RNA至关重要。目前常用的RNA抽提前血样保存的方法主要有低温冻存、PAXgene全血RNA管保存、样本中添加RNA保存液等^[5]。低温冻存是目前较为普遍的一种血样处理方法，使用乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管采集并储存外周血，过程简便、无须额外处理且可避免外源性因素的影响，但外周血中RNA容易受内源性因素［如大量存在的核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）^[6]］的影响，在收集和储存过程中RNA易发生降解。有研究^[7]证实，使用PAXgene全血RNA管保存能够显著提高从血样中分离出的RNA质量，但PAXgene全血RNA管过于昂贵，样本的收集成本过高。在血样中添加RNA保存液的方法可在采样地点即进行简单处理，既减少了外源性因素的影响，使外周血中的RNA得到保护，也降低了RNase对外周血中RNA的影响。

目前，有关RNA质量影响因素的研究主要包括提取方法^[8-9]、储存温度^[10]、冻融次数^[11]等方面。KIM等^[8]对冷冻血液使用TRIzol法、PAXgene全血RNA管法和NucleoSpin法抽提RNA并对其质量进行比较，结果显示，使用TRIzol法抽提得到的RNA纯度和完整性不能完全满足RNA测序等实验要求，而试剂盒抽提的RNA质量均能达到要求。何松哲等^[10]对外周血样本的保存方式及反复冻融对总RNA的影响进行了研究，将样本置于37 ℃、25 ℃、4 ℃、-20 ℃及-80 ℃条件下，储存时长设置为1、3、5和7 d，冻融1~3次，分别提取总RNA，结果表明，储存温度、储存时长和冻融次数对总RNA浓度及纯度均有明显影响。但目前有关样本预处理方法和储存时长的研究较少。因此，本研究选取8种不同的外周血预处理方法和6个储存时长，采用试剂盒法从外周血中提取总RNA，分析不同预处理方法和样本储存时长对RNA质量的影响，筛选出能够获得足量高质量RNA的预处理方法和最佳储存时长。

Centrifuge 5430小型高速离心机（德国Eppendorf公司），MX-F固定式混匀仪（美国Scilogex公司），Qubit^TM 2.0荧光计（美国Thermo Fisher Scientific公司），Epoch微孔板分光光度计（美国BioTek公司），2100生物分析仪（美国Agilent公司）。EDTA抗凝管（河北鑫乐医疗器械科技股份有限公司），PAXgene全血RNA管（美国BD公司），无核酸酶离心管和枪头（美国Axygen公司）。

Quick-RNA^TM Miniprep Plus试剂盒和DNA/RNA Shield^TM样本保存液（美国Zymo Research公司），RNA 6000 Nano试剂盒（美国Agilent公司），Qubit^TM RNA HS Assay试剂盒、TRIzol^TM试剂、RNAlater^TM稳定保存液（美国Thermo Fisher Scientific公司），异丙醇、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）。

选择3名健康无关个体，年龄为24~26岁。每个个体使用静脉采血针与5 mL EDTA抗凝管抽取外周血共25 mL，使用静脉采血针与10 mL PAXgene全血RNA管抽取外周血2.5 mL，所有采血管均颠倒10次充分混匀。

本研究已获得司法鉴定科学研究院伦理委员会批准（批准号为2019-08-01）。样本采集均遵循知情同意原则并签署知情同意书。

PAXgene RNA采血管室温下放置6 h，-20 ℃冰箱中放置24 h后转入-80 ℃冰箱中保存，使用时取出室温下静置，直至完全融化后颠倒混匀。

将EDTA抗凝管内的外周血取1 mL于1.5 mL无核酸酶离心管中，用不同的预处理方法进行处理，每份样本每种方法重复实验3次，室温平衡20 min后置于-80 ℃冰箱中保存。

以上操作均为无菌操作，所用物品均进行无RNase处理。

每份样本取0.8 mL均分装在2个1.5 mL无核酸酶离心管中（每管0.4 mL外周血），按外周血与DNA/RNA Shield^TM（1×）保存液1∶1.5的体积比，每管加入0.6 mL DNA/RNA Shield^TM（1×）保存液，轻轻振荡混匀后短暂离心，室温孵育20 min后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

每份样本取1 mL均分装在4个1.5 mL无核酸酶离心管中（每管250 μL外周血），按外周血与TRIzol^TM试剂1∶3的体积比，每管加入750 μL TRIzol^TM试剂，轻轻振荡混匀后短暂离心，室温孵育20 min后放入 -80 ℃冰箱保存1 d。

每份样本取1 mL分装在4个1.5 mL无核酸酶离心管中（每管250 μL外周血），按外周血与RNAlater^TM保存液1∶3的体积比，每管加入750 μL RNAlater^TM保存液，轻轻振荡混匀后短暂离心，室温孵育20 min后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

每份样本取0.8 mL置于1.5 mL无核酸酶离心管中，4 000×g离心10 min，弃去上清液。按沉淀（血细胞）与DNA/RNA Shield^TM（1×）保存液1∶1.5的体积比加入DNA/RNA Shield^TM（1×）保存液，轻轻振荡混匀后短暂离心，室温孵育20 min后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

每份样本取1 mL置于1.5 mL无核酸酶离心管中，新鲜抗凝血以4 000×g离心10 min，弃去上清液，并将沉淀全部转移到1.5 mL无核酸酶离心管中，按沉淀与红细胞裂解液1∶3的体积比将两者混匀，冰上静置10 min。4 000×g离心5 min，弃去上清液，按沉淀与红细胞裂解液1∶2的体积比将两者混匀，冰上静置5 min，4 000×g离心5 min，弃去上清液。加入1mL TRIzol^TM试剂，混匀后移液到1.5 mL无核酸酶离心管中，室温孵育20 min后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

每份样本取1 mL置于1.5 mL无核酸酶离心管中，新鲜抗凝血以4 000×g离心10 min，弃去上清液，并将沉淀全部转移到1.5 mL无核酸酶离心管中，按沉淀与红细胞裂解液1∶3的体积比将两者混匀，冰上静置10 min。4 000×g离心5 min，弃去上清液，按沉淀与红细胞裂解液1∶2的体积比将两者混匀，冰上静置5 min，4 000×g离心5 min，弃去上清液。加入1 mL RNAlater^TM保存液，混匀后移液到1.5 mL无核酸酶离心管中，室温孵育20 min后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

每份样本取0.8 mL置于1.5 mL无核酸酶离心管中，轻轻振荡混匀后短暂离心，室温孵育20 min后放入-80 ℃冰箱保存1 d。此方法的样本未经任何处理，作为空白对照组。

采集完外周血后，将PAXgene全血RNA管在室温下放置6 h，-20 ℃冰箱中放置24 h后转入-80 ℃冰箱中保存。

1.3.1~1.3.7节的预处理法采用EDTA抗凝管收集血液，1.3.8节预处理法采用PAXgene全血RNA管收集血液。

选取外周血加DNA/RNA Shield^TM对3名健康志愿者的外周血进行预处理。外周血起始量均为1 mL，经预处理后在-80 ℃条件下分别保存0、5、10、15、30和60 d。

先将样本从-80 ℃冰箱中取出，室温下融化。按照Quick-RNA^TM Miniprep Plus试剂盒操作说明书对经过不同方法预处理的样本进行总RNA抽提，得到洗脱体积为50 μL的RNA提取物。具体步骤如下。

①每1 mL样本混合液中加入20 μL PK充分混匀，室温孵育30 min；

②孵育后加入等体积的异丙醇混匀；

③混匀后的液体依次加入过滤柱，10 000×g离心1 min，弃掉滤液；

④过滤柱中加入0.4 mL RNA漂洗缓冲液，10 000×g离心1 min，弃掉滤液；

⑤按照每份样本5 μL DNaseⅠ和75 μL DNA裂解液的比例加入无核酸酶离心管混匀，向过滤柱加入80 μL DNaseⅠ混合液，室温孵育15 min；

⑥加入0.4 mL RNA预洗缓冲液，10 000×g离心1 min，弃掉滤液；

⑦加入0.7 mL RNA漂洗缓冲液，10 000×g离心1 min，弃掉滤液；

⑧加入0.4 mL RNA漂洗缓冲液，10 000×g离心2 min，弃掉滤液；

⑨加入50 μL无核酸酶水，将RNA从过滤柱中洗脱出来。

①将样本混合液与乙醇（95%~100%）按1∶1的体积比混匀；

后续步骤同1.5.1节③~⑨。

①将样本混合液与无核酸酶水按1∶1的体积比混匀；

②将混合液与RNA裂解液按1∶4的体积比混匀，混匀后加入过滤柱，4 000×g离心1 min，留过滤液；

③加入等体积的乙醇（95%~100%）混匀，混匀后加入过滤柱，10 000×g离心1 min，弃掉滤液；

后续步骤同1.5.1节④~⑨。

①每1 mL样本混合液中加入20 μL PK充分混匀，室温孵育30 min；

②孵育后加入等体积的异丙醇混匀；

后续步骤同1.5.1节③~⑨。

①将混合液与乙醇（95%~100%）按2∶1的体积比混匀；

后续步骤同1.5.1节③~⑨。

①将样本混合液与无核酸酶水按1∶1的体积比混匀；

②将混合液与RNA裂解液按1∶4的体积比混匀，混匀后加入过滤柱，4 000×g离心1 min，留过滤液；

③加入等体积的乙醇（95%~100%）混匀；

后续步骤同1.5.1节③~⑨。

①将样本混合液与DNA/RNA Shield^TM（2×）保存液按1∶1的体积比混匀；

②每0.1 mL样本混合液中加入2 μL PK充分混匀，室温孵育30 min；

③将混合液与异丙醇按1∶2的体积比混匀；

后续步骤同1.5.1节③~⑨。

①3 000×g~5 000×g离心10 min，弃去上清液；

②加入4 mL无核酸酶水，涡旋混匀后3 000×g~5 000×g离心10 min，弃去上清液；

③加入DNA/RNA Shield^TM（1×）保存液使沉淀全部浸没，每0.3 mL样本加入30 μL DNA裂解液和15 μL PK，混匀后55 ℃孵育30 min；

④混匀后以最大速度离心2 min，将上清液转移至试管内；

⑤加入等体积的RNA裂解液并混匀，加入过滤柱后离心，留过滤液；

⑥加入等体积的乙醇（95%~100%）混匀；

后续步骤同1.5.1节③~⑨。

在Qubit^TM 2.0荧光计上使用Qubit^TM RNA HS Assay试剂盒测定提取所得RNA的浓度，使用Epoch微孔板分光光度计测定提取所得RNA的纯度（D₂₆₀/D₂₈₀），浓度和纯度均重复测量3次，取平均值。使用2100生物分析仪测定提取所得RNA的完整性（RNA integrity number，RIN）。

RNA质量主要从产量、纯度和RIN值3个方面进行评判。其中RNA产量需根据RNA洗脱体积与RNA浓度来计算。由于本研究各组外周血起始量略有差异，因此，将不同外周血起始量所得RNA浓度与洗脱体积之积统一换算成每毫升外周血起始量所得RNA产量。RNA纯度在1.8~2.0范围表明样本的纯度较高，D₂₆₀/D₂₈₀值<1.8表明有蛋白质或酚污染，而D₂₆₀/D₂₈₀值>2.0表明有异硫氰酸胍等物质污染。RIN值能够反映样本RNA的降解程度，RIN值一般在0（完全降解）至10（完整未降解）之间^[12]，样本RNA的RIN值大于7时可认为完整性较好。

RNA产量、RNA纯度以及RIN值均采用x¯±s的形式表示。采用SPSS 22.0软件（美国IBM公司）对数据进行处理，利用配对t检验和单因素方差分析分别对不同预处理方法和储存时长的样本抽提得到的RNA产量、纯度及完整性进行统计分析并制作图表。检验水准α=0.05。

对不同预处理方法处理的血样抽提RNA后，测量RNA纯度、RIN值、RNA浓度和RNA产量见表1。各预处理组使用2100生物分析仪得到凝胶电泳图谱（图1）。

对各组样本所得的RNA纯度进行分析，首先根据预处理方法将样本分为8组进行配对t检验，结果显示，部分预处理方法之间RNA纯度差异具有统计学意义。白细胞加RNAlater^TM法和直接冻存法的RNA纯度低于1.8，PAXgene全血RNA管法的RNA纯度略高于2.0，其余5组纯度较好且组间差异无统计学意义（P>0.05）。

对各组RIN值进行配对t检验，部分预处理方法之间RIN值差异具有统计学意义。结果显示，除直接冻存法外，其余预处理方法RIN值均大于7，可满足高通量测序等实验对样本的要求，仅外周血加DNA/RNA Shield^TM法和血细胞加DNA/RNA Shield^TM法与PAXgene全血RNA管法相比差异无统计意义，其余方法与PAXgene全血RNA管法相比，RIN值均较差且差异具有统计学意义（P<0.05）。

对不同预处理方法所得的RNA产量进行配对t检验，部分预处理方法之间RNA产量差异具有统计学意义。结果显示，外周血加TRIzol^TM法、白细胞加RNAlater^TM法和直接冻存法与其余5组相比产量较低，其中直接冻存法的产量与其余5组相比差异均具有统计学意义（P<0.05），白细胞加RNAlater^TM法产量明显低于白细胞加TRIzol^TM法（P<0.05）。

对于每一种预处理方法而言，同一预处理方法的不同样本在RNA纯度、RIN值以及RNA产量之间差异均无统计学意义，这表明实验结果不受样本因素影响。

不同储存时长下RNA纯度、RIN值、RNA浓度和RNA产量见表2。

对不同储存时长样本所得RNA的纯度进行分析，单因素方差分析结果显示，RNA纯度不受储存时长的影响（P>0.05）。各组纯度均在1.8~2.0范围内，可认为样本RNA纯度较好。

对不同储存时长样本所得RIN值进行分析，单因素方差分析结果显示，RIN值受储存时长的影响（P<0.05）。与直接进行RNA抽提的样本（储存0 d）相比，储存10 d及以上的样本RIN值均有明显降低且差异具有统计学意义（P<0.05）。

对不同储存时长样本所得RNA产量进行分析，单因素方差分析结果显示，RNA产量受储存时长的影响（P<0.05）。随着储存时长的增加，样本RNA的产量逐渐减少，与储存0 d样本相比，储存5 d起样本RNA产量下降明显且差异具有统计学意义（P<0.05）。

此外，样本之间在相同的储存时长下RNA纯度、RIN值以及RNA产量差异均无统计学意义，这表明实验结果不受样本因素影响。

外周血样本不仅是法医学实践中常见的一种检材，也是科学研究中常用的样本类型。一般情况下，因研究条件的限制，需要在外地或偏远地区采集外周血，采集现场条件各不相同且多数无法达到实验室条件，后续运输条件等不稳定因素都会对外周血中RNA的质量造成影响。离体后的外周血随时间的推移，血中的各种成分受到血细胞代谢、广泛存在的内源性RNase等诸多因素影响，RNA易发生降解，提取到的RNA数量和质量较差，难以满足诸如高通量测序等后续实验的要求^[13]，使得从外周血中提取高质量RNA成为一个很大的挑战。

本研究选取8种外周血样本预处理方法及6个储存时长，统一储存在-80 ℃条件下，采用试剂盒抽提的方法对样本进行抽提，对总RNA进行质量检测（浓度、纯度和完整性）并比较分析，从而选出最优的处理方法和适宜的储存时长范围。

在非实验室环境下采集样本后，直接冻存外周血是目前最普遍的样本处理方法，由于该方法没有使用任何具有稳定成分的添加剂，可作为对照组排除储存期间稳定剂的毒性或可能干扰实验的其他因素。LIU等^[5]对血液样本采取6种预处理方法，并使用TRIzol法和PAXgene试剂盒提取法进行抽提，结果显示，经过处理的样本完整性好于未经处理的样本。因此，本研究选取了8种样本预处理方法，以确定何种方法能达到提高样本中RNA质量的效果。

通过对实验结果进行统计分析，发现样本在冻存前进行预处理可有效提高RNA质量。除白细胞加RNAlater^TM法和直接冻存法的RNA纯度较低，PAXgene全血RNA管法RNA纯度均值略高于2.0外，其余5组RNA纯度较好，均在1.8~2.0。PAXgene全血RNA管法RIN值最高，样本RNA片段几乎未发生降解；直接冻存法RIN值最低且低于7.0，样本RNA发生了部分降解；其余各组RIN值均高于8.0。血细胞加DNA/RNA Shield^TM法RNA产量最高，其次为外周血加DNA/RNA Shield^TM法。在对整体结果进行分析时发现，白细胞添加TRIzol^TM和RNAlater^TM保存液的RNA质量要优于外周血添加TRIzol^TM和RNAlater^TM保存液。白细胞添加TRIzol^TM保存液的样本在RNA纯度、RIN值和产量3个方面均优于白细胞添加RNAlater^TM保存液的样本，且在RNA产量上差异具有统计学意义，这与LIU等^[5]对外周血预处理方法研究中部分相同方法所得结果一致。经过上述比较分析，外周血加DNA/RNA Shield^TM、血细胞加DNA/RNA Shield^TM、白细胞加TRIzol^TM和PAXgene全血RNA管4种方法在纯度、RIN值和产量方面均较好。相比其余3种方法，PAXgene全血RNA管的成本较高，不适用于大规模的样本采集，同时在采集后需至少2 d时间才能够低温运输，其余3种方法中，外周血加DNA/RNA Shield^TM法相对操作步骤最少，能最大限度减少外源性污染，由于抽提试剂盒内含有DNA/RNA Shield^TM，无须单独购买，添加DNA/RNA Shield^TM保存的样本抽提出DNA的RIN值均高于其余两种方法。

外地采集的外周血样本经过处理并低温运输到实验室进行处理的过程中，无法确定样本的储存时长。目前有关保存时间的研究^[11，14]储存时长设为0 d（立即抽提）至10 d，结果表明，随着储存时长的增加，RNA逐渐发生降解且与立即抽提得到的RNA相比差异具有统计学意义。因此，本研究选取了6个储存时长（0、5、10、15、30和60 d）从产量、纯度和RIN值3个方面对样本储存时长对RNA质量的影响进行了评估。通过对实验结果进行统计分析发现，储存时长对RNA纯度无明显影响，纯度保持在1.815~1.952。随着储存时长的增加，RNA浓度、产量及RIN值均呈现下降趋势，其中RNA产量除在10 d与15 d、30 d与60 d的比较差异无统计学意义外，其余各组间差异均有统计学意义，储存60 d样本的RNA产量已无法满足RNA测序等实验要求。而RIN值在10 d起出现下降，除30 d与60 d比较差异无统计学意义外，在储存10 d及以上的各组间RIN值差异均有统计学意义，到储存60 d时RIN值已降至RNA测序等实验要求的最低值^[12]。本研究部分结果与何松哲等^[10]、洪恩宇等^[11]关于储存时长对RNA质量影响的结果基本一致。

本研究对RNA纯度是否受储存时长的影响与何松哲等^[10]研究结果不同，考虑可能是随着储存时长的增加，红细胞裂解以及血中大量内源性RNase的释放，外周血中蛋白大量增加，从而改变了RNA纯度。而本研究对外周血样本中添加了DNA/RNA Shield^TM保存液，对外周血中的RNA起到了保护作用，减小了RNA质量的降低。因此，本研究储存10 d的样本在RNA浓度和RIN值上要明显优于其他研究^[11]储存7 d的样本RNA质量。

对外地采集或无法立即进行实验的外周血样本进行冷冻前预处理，可确保能够获得大量高质量RNA，从而保证转录组分析等检测技术的成功。本研究结果显示，外周血加DNA/RNA Shield^TM保存液的方法是样本最佳预处理方法，经过该方法预处理的样本在低温条件下最多可存放60 d，其质量也可满足高通量测序等下游实验的要求。总而言之，对需要一定时间保存的样本进行预处理是一种能有效保障RNA质量的方法，可应用于RNA抽提前的外周血样本保存。