外周血不同预处理方法及储存时长对RNA质量的影响

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2020.500701

法医学杂志 ›› 2021, Vol. 37 ›› Issue (6): 825-831.DOI: 10.12116/j.issn.1004-5619.2020.500701

外周血不同预处理方法及储存时长对RNA质量的影响

张佳怡¹^,²^,³(), 徐倩南¹^,⁴, 刘希玲¹(), 李成涛¹^,²()

^1.司法鉴定科学研究院上海市法医学重点实验室司法部司法鉴定重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063
^2.内蒙古医科大学法医学教研室，内蒙古呼和浩特 010030
^3.南方医科大学法医学院，广东广州 510515
^4.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都 610041

收稿日期:2020-06-30 发布日期:2021-12-25 出版日期:2021-12-28
通讯作者: 刘希玲,李成涛
作者简介:刘希玲，女，副研究员，硕士研究生导师，主要从事法医遗传学研究；E-mail：liuxl@ssfjd.cn
李成涛，男，研究员，博士研究生导师，主要从事法医遗传学研究；E-mail：lichengtaohla@163.com
张佳怡（1994—），女，硕士研究生，主要从事法医遗传学研究；E-mail：2472509805@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81871534);中央级科研院所公益专项(GY2021G-2);司法部司法鉴定重点实验室资助项目;上海市法医学重点实验室资助项目(21DZ2270800);上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目(19DZ2292700)

Effects of Peripheral Blood Different Pretreatment Methods and Preservation Time on RNA Quality

Jia-yi ZHANG¹^,²^,³(), Qian-nan XU¹^,⁴, Xi-ling LIU¹(), Cheng-tao LI¹^,²()

^1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine, Key Laboratory of Forensic Science, Ministry of Justice, Shanghai Forensic Service Platform, Academy of Forensic Science, Shanghai 200063, China
^2.Department of Forensic Medicine, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, China
^3.School of Forensic Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
^4.West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China

Received:2020-06-30 Online:2021-12-25 Published:2021-12-28
Contact: Xi-ling LIU,Cheng-tao LI

摘要/Abstract

摘要： 目的

评估外周血不同预处理方法以及储存时长对RNA质量的影响，优化外周血的保存方法。

方法

选取8种预处理方法对3名健康无关个体的外周血进行预处理并保存在-80 ℃条件下，使用Quick-RNA^TM Miniprep Plus试剂盒提取样本总RNA。采用外周血添加DNA/RNA Shield^TM的方法对外周血样本进行处理后于-80 ℃条件下分别保存0、5、10、15、30和60 d后抽提总RNA并测定RNA的浓度、纯度以及完整性。采用SPSS 22.0软件对RNA的产量、纯度以及完整性进行比较。

结果

纯度方面，白细胞加RNAlater^TM法和直接冻存法最差，其余6种方法纯度较好；产量方面，血细胞加DNA/RNA Shield^TM法产量最高，外周血加DNA/RNA Shield^TM法次之；完整性方面，PAXgene全血RNA管法最好，除外周血加DNA/RNA Shield^TM法和血细胞加DNA/RNA Shield^TM法外，其余5种与PAXgene全血RNA管法比较差异均具有统计学意义。6个储存时长的RNA纯度均在1.815~1.952，随着储存时长的增加，RNA产量和完整性均下降，其中产量从4.516 ng降至1.039 ng，完整性由8.533降至7.150。

结论

综合RNA产量、纯度及完整性等因素，加DNA/RNA Shield^TM是一种较为理想的外周血预处理方法。在此基础上，样本可在低温条件下储存最多60 d。

关键词: 法医遗传学, 核糖核酸, 预处理, 储存时长, 外周血

Abstract: Objective

To evaluate the effects of different pretreatment methods and preservation time on RNA quality of peripheral blood samples, and to optimize the preservation method of peripheral blood samples.

Methods

Eight pretreatment methods were used to preprocess the peripheral blood from 3 healthy unrelated individuals and the treated samples were stored at -80 ℃. Total RNA of samples was extracted using Quick-RNA^TM Miniprep Plus kit. DNA/RNA Shield^TM was added to peripheral blood and total RNA was extracted after preservation at -80 ℃ for 0, 5, 10, 15, 30 and 60 days, respectively. The concentration, purity and integrity of RNA were determined. Statistical analyses were performed by SPSS 22.0 software to compare the differences in RNA yield, purity and integrity among the eight pretreatment methods.

Results

In terms of purity, leukocyte pretreated with RNAlater^TM and directly cryopreservation peripheral blood showed the worst purity. The other six methods showed better purity. In terms of yield, blood cells with DNA/RNA Shield^TM came out with the highest yield, followed by peripheral blood with DNA/RNA Shield^TM. In terms of integrity, peripheral blood preserved in PAXgene Blood RNA tube method had the best integrity. Except for peripheral blood pretreated with DNA/RNA Shield^TM and blood cells pretreated with DNA/RNA shield^TM, the other five methods had statistical differences when compared to the method by keeping peripheral blood in PAXgene Blood RNA tube. The purity of RNA stored at six-time gradients ranged from 1.815 to 1.952. With the increase of storage time, RNA yield decreased from 4.516 ng to 1.039 ng, and RNA integrity decreased from 8.533 to 7.150.

Conclusion

According to the results of total RNA’s yield, purity and integrity, peripheral blood pretreated with DNA/RNA Shield^TM was the best pretreatment method. After the pretreatment, samples can be preserved for up to 60 days in low temperature.

Key words: forensic genetics, ribonucleic acid （RNA）, pretreatment, storage time, peripheral blood

中图分类号:

DF795.2

张佳怡, 徐倩南, 刘希玲, 李成涛. 外周血不同预处理方法及储存时长对RNA质量的影响[J]. 法医学杂志, 2021, 37(6): 825-831.

Jia-yi ZHANG, Qian-nan XU, Xi-ling LIU, Cheng-tao LI. Effects of Peripheral Blood Different Pretreatment Methods and Preservation Time on RNA Quality[J]. Journal of Forensic Medicine, 2021, 37(6): 825-831.

图/表 3

表1 外周血样本8种预处理方法提取总RNA纯度、完整性、质量浓度和产量的比较 (n=3)

Tab. 1 Comparison of purity， integrity， mass concentration and yield of total RNAof peripheral blood samples extracted by 8 pretreatment methods

预处理方法	纯度/（ $x ˉ$ ±s）	RIN/（ $x ˉ$ ±s）	质量浓度/ （ $x ˉ$ ±s，ng·μL^-1）	产量/μg
预处理方法	纯度/（ $x ˉ$ ±s）	RIN/（ $x ˉ$ ±s）	质量浓度/ （ $x ˉ$ ±s，ng·μL^-1）	$x ˉ$ ±s	最大值	最小值
外周血加DNA/RNA Shield^TM	1.837±0.020	8.467±0.038	48.567±4.773	3.035±0.298	4.069	2.519
外周血加TRIzol^TM	1.893±0.030	8.167±0.195	39.533±1.707	1.977±0.085	2.261	1.764
外周血加RNAlater^TM	1.863±0.150	8.033±0.158	45.022±3.436	2.251±0.172	1.899	2.853
血细胞加DNA/RNA Shield^TM	1.900±0.011	8.200±0.129	58.667±5.859	3.847±0.170	5.331	2.500
白细胞加TRIzol^TM	1.814±0.016	8.200±0.120	49.363±1.205	2.468±0.060	2.289	2.650
白细胞加RNAlater^TM	1.621±0.046	8.133±0.135	32.413±0.926	1.621±0.046^1）	1.486	1.763
直接冻存	1.125±0.044^2）	5.583±0.132^{1）2）3）4）5）6）}	12.786±2.568	1.728±0.287^{1）2）3）5）}	4.861	0.250
PAXgene全血RNA管	2.030±0.002^{1）3）5）6）7）}	9.433±0.154^{1）2）4）6）7）}	12.836±6.139	2.457±0.123^7）	2.242	2.882

表1 外周血样本8种预处理方法提取总RNA纯度、完整性、质量浓度和产量的比较 (n=3)

Tab. 1 Comparison of purity， integrity， mass concentration and yield of total RNAof peripheral blood samples extracted by 8 pretreatment methods

预处理方法	纯度/（ $x ˉ$ ±s）	RIN/（ $x ˉ$ ±s）	质量浓度/ （ $x ˉ$ ±s，ng·μL^-1）	产量/μg
预处理方法	纯度/（ $x ˉ$ ±s）	RIN/（ $x ˉ$ ±s）	质量浓度/ （ $x ˉ$ ±s，ng·μL^-1）	$x ˉ$ ±s	最大值	最小值
外周血加DNA/RNA Shield^TM	1.837±0.020	8.467±0.038	48.567±4.773	3.035±0.298	4.069	2.519
外周血加TRIzol^TM	1.893±0.030	8.167±0.195	39.533±1.707	1.977±0.085	2.261	1.764
外周血加RNAlater^TM	1.863±0.150	8.033±0.158	45.022±3.436	2.251±0.172	1.899	2.853
血细胞加DNA/RNA Shield^TM	1.900±0.011	8.200±0.129	58.667±5.859	3.847±0.170	5.331	2.500
白细胞加TRIzol^TM	1.814±0.016	8.200±0.120	49.363±1.205	2.468±0.060	2.289	2.650
白细胞加RNAlater^TM	1.621±0.046	8.133±0.135	32.413±0.926	1.621±0.046^1）	1.486	1.763
直接冻存	1.125±0.044^2）	5.583±0.132^{1）2）3）4）5）6）}	12.786±2.568	1.728±0.287^{1）2）3）5）}	4.861	0.250
PAXgene全血RNA管	2.030±0.002^{1）3）5）6）7）}	9.433±0.154^{1）2）4）6）7）}	12.836±6.139	2.457±0.123^7）	2.242	2.882

图1 外周血样本8种预处理方法的电泳图谱①为外周血加DNA/RNA ShieldTM法，②为外周血加TRIzolTM法，③为外周血加RNAlaterTM法，④为血细胞加DNA/RNA ShieldTM法，⑤为白细胞加TRIzolTM法，⑥为白细胞加RNA-laterTM法，⑦为直接冻存法，⑧为PAXgene全血RNA管法。

Fig. 1 Electrophoretogram of peripheral blood samplesfrom 8 pretreatment methods

表2 外周血样本不同储存时长提取总RNA纯度、完整性、质量浓度和产量的比较

Tab. 2 Comparison of purity， integrity， mass concentration and yield of total RNAof peripheral blood samples extracted at different storage times

储存时长/d	纯度/（ $x ˉ$ ±s）	RIN/（ $x ˉ$ ±s）	质量浓度/ （ $x ˉ$ ±s，ng·μL^-1）	产量/μg
储存时长/d	纯度/（ $x ˉ$ ±s）	RIN/（ $x ˉ$ ±s）	质量浓度/ （ $x ˉ$ ±s，ng·μL^-1）	$x ˉ$ ±s	最大值	最小值
0	1.883±0.008	8.533±0.038	90.321±3.344	4.516±0.167	4.515	4.015
5	1.875±0.007	8.400±0.033	72.133±1.545	3.607±0.077^1）	3.760	3.340
10	1.892±0.009	8.267±0.038^1）	57.400±2.774	2.870±0.139^1）2）	3.330	2.520
15	1.900±0.016	8.133±0.038^1）2）	45.623±3.199	2.281±0.160^1）2）	2.812	1.879
30	1.842±0.012	7.667±0.102^{1）2）3）4）}	29.399±1.747	1.475±0.087^{1）2）3）4）}	1.767	1.260
60	1.878±0.009	7.150±0.306^{1）2）3）4）}	20.790±1.001	1.039±0.050^{1）2）3）4）}	1.198	0.900

表2 外周血样本不同储存时长提取总RNA纯度、完整性、质量浓度和产量的比较

Tab. 2 Comparison of purity， integrity， mass concentration and yield of total RNAof peripheral blood samples extracted at different storage times

储存时长/d	纯度/（ $x ˉ$ ±s）	RIN/（ $x ˉ$ ±s）	质量浓度/ （ $x ˉ$ ±s，ng·μL^-1）	产量/μg
储存时长/d	纯度/（ $x ˉ$ ±s）	RIN/（ $x ˉ$ ±s）	质量浓度/ （ $x ˉ$ ±s，ng·μL^-1）	$x ˉ$ ±s	最大值	最小值
0	1.883±0.008	8.533±0.038	90.321±3.344	4.516±0.167	4.515	4.015
5	1.875±0.007	8.400±0.033	72.133±1.545	3.607±0.077^1）	3.760	3.340
10	1.892±0.009	8.267±0.038^1）	57.400±2.774	2.870±0.139^1）2）	3.330	2.520
15	1.900±0.016	8.133±0.038^1）2）	45.623±3.199	2.281±0.160^1）2）	2.812	1.879
30	1.842±0.012	7.667±0.102^{1）2）3）4）}	29.399±1.747	1.475±0.087^{1）2）3）4）}	1.767	1.260
60	1.878±0.009	7.150±0.306^{1）2）3）4）}	20.790±1.001	1.039±0.050^{1）2）3）4）}	1.198	0.900

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Effects of Peripheral Blood Different Pretreatment Methods and Preservation Time on RNA Quality

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