MD-VF-Auto SEM法与浮游生物基因复合扩增体系在溺死诊断中的应用比较
张健苗 , 1 , 林添春 1 , 廖振瑜 1 , 杜宇坤 2 , 余仲昊 2 , 刘景建 3 , 伍赛群 4 , 康晓东 5 , 徐曲毅 5 , 石河 5 , 赵建 5 , 刘超 , 5 , 谷党恩 , 1
1.广州市公安局花都区分局，广东 广州 510800
2.南方医科大学法医学院，广东 广州 510515
3.昆明医科大学法医学院，云南 昆明 650500
4.广东省公安厅，广东 广州 510030
5.广州市刑事科学技术研究所 法医病理学公安部重点实验室，广东 广州 510442
Comparison of Application of MD-VF-Auto SEM Method and Plankton Gene Multiplex PCR System in the Diagnosis of Drowning
ZHANG Jian-miao , 1 , LIN Tian-chun 1 , LIAO Zhen-yu 1 , DU Yu-kun 2 , YU Zhong-hao 2 , LIU Jing-jian 3 , WU Sai-qun 4 , KANG Xiao-dong 5 , XU Qu-yi 5 , SHI He 5 , ZHAO Jian 5 , LIU Chao , 5 , GU Dang-en , 1
1.Huadu District Branch of Guangzhou Public Security Bureau, Guangzhou 510800, China
2.School of Forensic Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
3.College of Forensic Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, China
4.Guangdong Provincial Public Security Department, Guangzhou 510030, China
5.Guangzhou Forensic Science Institute & Key Laboratory of Forensic Pathology, Ministry of Public Security, Guangzhou 510442, China
通讯作者: 刘超，男，博士，主任法医师，主要从事个体识别及死因鉴定研究；E-mail：liuchaogzf@163.com 谷党恩，男，副主任法医师，主要从事法医病理学检验和溺死诊断研究；E-mail：gudn@sohu.com
编委: 李正东
收稿日期: 2021-06-14
基金资助:
广州市科技计划资助项目 . 2019030001 . 2019030011 . 2019030012 法医病理学公安部重点实验室开放课题资助项目 . GAFYBL201909 公安部科技强警基础工作专项资助项目 . 2020GABJC38
摘要
目的 比较微波消解-真空抽滤-自动扫描电子显微镜（microwave digestion - vacuum filtration - automated scanning electron microscopy，MD-VF-Auto SEM）法与浮游生物基因复合扩增体系在溺死诊断中的应用效果。 方法 采用MD-VF-Auto SEM法和浮游生物基因复合扩增体系分别对10例非溺死案例和50例溺死案例的肺、肝、肾组织进行检测分析，比较两种方法在各组织中的阳性检出率。 结果 溺死案例使用MD-VF-Auto SEM法检验的硅藻阳性率为100%，在6例非溺死案例的肝、肾组织中检出少量硅藻。浮游生物基因复合扩增体系的阳性率为84%，非溺死案例的肺、肝、肾组织结果均为阴性。两种方法检测结果相比，肝、肾组织的阳性率和总阳性率差异均具有统计学意义（P <0.05），而肺组织阳性率差异无统计学意义（P >0.05）。 结论 MD-VF-Auto SEM法对硅藻检验具有较高的灵敏度，而浮游生物基因复合扩增体系还可检出硅藻外的其他浮游生物。两种方法相结合，可为溺死诊断提供更可靠的依据。
关键词：
法医病理学 溺死 硅藻检验 浮游生物 复合扩增体系 微波消解-真空抽滤-自动扫描电子显微镜法
Abstract
Objective To compare the application effect of microwave digestion - vacuum filtration - automated scanning electron microscopy （MD-VF-Auto SEM） method and plankton gene multiplex PCR system in the diagnosis of drowning. Methods Lung, liver and kidney tissue of 10 non-drowning cases and 50 drowning cases were prepared for further MD-VF-Auto SEM method analysis and plankton gene multiplex PCR system analysis. The positive detection rate of the two methods in each tissue was calculated. Results The positive rate of the MD-VF-Auto SEM method detecting diatoms in drowning cases was 100%, and few diatoms were detected in the liver and kidney tissues of 6 non-drowning cases. By using the plankton gene multiplex PCR system, the diatom positive rate of drowning cases was 84%, and all the non-drowning cases were negative. There were significant differences in the positive rate of the liver, kidney tissues between MD-VF-Auto SEM method and plankton gene multiplex PCR system （P <0.05）, as well as the total positive rate of cases. However, no significant differences were found in the positive rates of lung tissues （P >0.05）. Conclusion MD-VF-Auto SEM method is more sensitive than plankton gene multiplex PCR system in diatom test. But the plankton gene multiplex PCR system can also detect plankton other than diatoms. Combination of the two methods can provide a more reliable basis for the diagnosis of drowning.
Keywords：
forensic pathology drowning diatom test plankton multiplex PCR system microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy method
本文引用格式
张健苗, 林添春, 廖振瑜, 杜宇坤, 余仲昊, 刘景建, 伍赛群, 康晓东, 徐曲毅, 石河, 赵建, 刘超, 谷党恩. MD-VF-Auto SEM法与浮游生物基因复合扩增体系在溺死诊断中的应用比较 . 法医学杂志 [J], 2022, 38(1): 114-118 DOI:10.12116/j.issn.1004-5619.2021.410605
ZHANG Jian-miao, LIN Tian-chun, LIAO Zhen-yu, DU Yu-kun, YU Zhong-hao, LIU Jing-jian, WU Sai-qun, KANG Xiao-dong, XU Qu-yi, SHI He, ZHAO Jian, LIU Chao, GU Dang-en. Comparison of Application of MD-VF-Auto SEM Method and Plankton Gene Multiplex PCR System in the Diagnosis of Drowning . Journal of Forensic Medicine 10.12116/j.issn.1004-5619.2021.410605
水中尸体的死因鉴定是法医工作的重点和难点。在溺死过程中，硅藻等浮游生物会随溺液吸入死者的肺内，其中一部分硅藻穿透肺泡-毛细血管屏障进入肺血管，并通过体循环到达肝、肾、骨髓等组织器官[1 -2 ] ，因此，一般认为在死者内部组织器官中检出硅藻等浮游生物是诊断溺死的一种可靠依据[3 -6 ] 。
浮游生物中关于硅藻检验的研究较多。经典的硅藻检验方法一般先通过强酸消化法、胰蛋白酶消化法等去除组织中的有机质，然后富集组织消解液中的硅藻，在显微镜下根据硅藻的形态进行观察和分类[7 -10 ] 。在此原理基础上，研发了微波消解-真空抽滤-自动扫描电子显微镜（microwave digestion - vacuum filtration - automated scanning electron microscopy，MD-VF-Auto SEM）法，其可靠性在多年来的实践中得到证实[9 -10 ] 。近年来，以分子生物学技术检测浮游生物相关靶基因用于溺死诊断成为法医学领域的研究热点，并研发了一种包含12对特异性引物的浮游生物基因复合扩增体系[11 ] ，且具有良好的特异性和稳定性。
本研究拟应用MD-VF-Auto SEM法和浮游生物基因复合扩增体系，对10例非溺死案件和50例溺死案件进行分析，比较2种方法在法医学鉴定中的应用效能。
1 材料与方法
1.1 样本
收集广州市刑事科学技术研究所2020年5月—2021年5月鉴定的10例陆地上死亡的非溺死尸体（编号1~10号）和50例溺死尸体（编号11~60号）。溺死的诊断依据为通过案情调查或有目击者确认溺死，具有溺死的典型病理特征[5 ] ，排除镇静催眠类、有机磷类、毒品及灭鼠药类等常规毒（药）物中毒。非溺死案例的死因为颅脑损伤、机械性窒息和电击死。根据《法庭科学 硅藻检验技术规范 微波消解-真空抽滤-显微镜法》（GA/T 1662—2019）[12 ] 进行组织样本提取，样本置于-80 ℃冰箱冷冻保存以进一步检验。本研究由广州市刑事科学技术研究所批准。
每例分别提取肺组织2 g、肝组织10 g、肾组织10 g，用于MD-VF-Auto SEM法。每例分别提取肺组织、肝组织、肾组织各0.5 g，用于浮游生物基因复合扩增体系检验。
1.2 MD-VF-Auto SEM法
1.2.1 组织处理
提取的肺、肝、肾组织分别置于消解管中，加入8 mL 65%硝酸溶液（德国Merck公司）和2 mL 30%过氧化氢溶液（德国Merck公司）。
1.2.2 微波消解
将消解管置于Multiwave 7000微波消解仪（奥地利Anton Paar公司）中进行消解。程序设定：5 min内功率由0 W升至800 W，保持10 min；强风冷却30 min。
1.2.3 真空抽滤
水样与硝酸以体积比5∶1加入纯水置消解管中，倒入滤杯中使用HL-6多联真空抽滤仪（珠海黑马医学仪器有限公司）抽滤。取出滤膜烘干制备样品座。
1.2.4 扫描电子显微镜观察
将样品座置于Phenom XL G2台式扫描电子显微镜（美国PhenomWorld公司）下观察，放大倍数400倍，记录观察到的硅藻总数。
1.3 浮游生物基因复合扩增体系检验
1.3.1 引物设计
浮游生物基因复合扩增体系由12对引物组成（表1 ），分别针对硅藻、蓝藻和气单胞菌的特异基因，选取其在GenBank数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ ）中的特异性基因，使用Applied BiosystemsTM Primer ExpressTM v3.0.1软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）设计特异性引物。将引物分为2组，分别用FAM、HEX荧光标记。
1.3.2 DNA提取
提取的肺、肝、肾组织剪碎后分别置于2 mL微量离心管中，加入10 μL PK、10 μL二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）及700 μL细胞裂解液。微量离心管放入ThermoStatTM C孵育器（德国Eppendorf公司）进行预处理：56 ℃ 3 h。根据PowerSoilTM DNA Isolation试剂盒（德国Qiagen公司）说明书提取DNA，-20 ℃保存待检。
1.3.3 聚合酶链反应-毛细管电泳技术
PCR在VeritiTM 96孔热循环仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）中进行。10 μL PCR扩增反应体系：反应混合液4 μL，引物2 μL，C-Taq DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板1 μL和灭菌双蒸水2.6 μL。反应条件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。
在3130xl 基因分析仪（美国Applied Biosystems公司）中进行毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）分离，上样体系：扩增产物1 μL，AGCU Marker SIZ-500 0.5 μL和去离子甲酰胺10.0 μL。使用Gene- Mapper ID-X 1.4（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行结果分析，并将峰值检验阈值设置为100相对荧光单位（relative fluorescence units，RFU）。
1.4 统计学分析
肺、肝、肾组织检出硅藻或浮游生物基因，即判断为检出阳性；肺组织检出阳性的基础上，肝、肾任一组织检出阳性即判断为溺死。采用SPSS 24.0软件（美国IBM公司）进行统计分析。根据数据分布形式，将MD-VF-Auto SEM法与浮游生物基因复合扩增体系检验阳性率进行χ2 检验，检验水准α =0.05。
2 结果
2.1 MD-VF-Auto SEM法检验结果
50例溺死尸体肺组织硅藻含量为（197 847.10±354 617.77）个/10 g，肝组织硅藻含量为（68.56±228.51）个/10 g，肾组织硅藻含量为（1 671.46±10 115.07）个/10 g；10例非溺死尸体肺组织均未检出硅藻，有6例肝或肾组织中检出了少量硅藻（2~8个/10 g）。如表2 所示，50例溺死尸体总阳性率为100%。
2.2 浮游生物基因复合扩增体系检验结果
50例溺死尸体肺组织基因座平均检出（5.96±3.74）个，肝组织基因座平均检出（2.00±2.07）个，肾组织基因座平均检出（2.78±3.25）个；10例非溺死尸体的肺、肝或肾组织均未检出硅藻基因座。如表2 所示，50例溺死尸体总阳性率为84%。溺死尸体肺、肝、肾组织硅藻基因分型的典型图谱见图1 。
图1
图1
浮游生物基因复合扩增体系检验溺死尸体的基因分型图谱
A：肺组织；B：肝组织；C：肾组织。
Fig. 1
Genotyping map of drowning cases examined by plankton gene multiplex PCR system
2.3 两种方法的比较
从实验过程来看，浮游生物基因复合扩增体系检验相较MD-VF-Auto SEM法操作步骤简单，耗费的时间更短。从统计分析结果来看（表2 ），MD-VF-Auto SEM法与浮游生物基因复合扩增体系在肝、肾组织的阳性率和总阳性率之间差异均有统计学意义（P <0.05），但两种方法对肺组织硅藻的检出阳性率之间差异无统计学意义（P >0.05）。
3 讨论
硅藻是一种单细胞水生生物，广泛分布于各种自然水体，具有复杂的种群动态与生态学特征[13 ] 。硅藻检验最广泛使用的方法是强酸消解、离心和光学显微镜观察。传统的硅藻检验方法由于灵敏度不高、具有一定的假阳性率，其辅助溺死诊断的价值受到一定程度的质疑[14 -15 ] 。
MD-VF-Auto SEM法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9 -10 ] 。相比反复的离心富集，0.45 μm孔径的滤膜（硅藻最小长度>1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16 ] ，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构。一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17 ] 。本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%。尽管3种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异。肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1~10个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g。通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18 -20 ] 。部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2~8个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21 ] 相似。通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17 -20 ] 。
本研究所使用的浮游生物基因复合扩增体系包含12对引物，不仅可检出9种硅藻，而且还可以检验出7种蓝藻和5种气单胞菌[11 ] ，这些都是水体中常见的水生生物，其体积更小，在溺死过程中更容易通过气-血屏障进入体循环。理论上，检出ND-A、ND-B 和UPA 表明存在硅藻，CBR 表明存在蓝藻，rPOD-A、rPOD-B、HLYA-A、HLYA-B、HLYA-C、AER-A、AER-B 和AER-C 表明存在气单胞菌。而本研究中浮游生物基因复合扩增体系在10个非溺死尸体的肺、肝、肾组织中均未检出以上12个基因座，这可能是由于无法在活体组织内存活，死亡后硅藻DNA降解，只有硅藻的硅质细胞壁被保留在组织内。浮游生物基因复合扩增体系有助于排除生前体内的硅藻沉积，只能检出进入组织的新鲜浮游生物。浮游生物基因复合扩增体系对50例溺死尸体肺、肝、肾组织的阳性率分别为92%、78%、76%，总阳性率为84%。肝、肾组织的阳性率和总阳性率均低于MD-VF-Auto SEM法（P <0.05）。虽然浮游生物基因复合扩增体系检验的浮游生物更多，但受限于取样量（0.5 g），使其阳性率低于MD-VF-Auto SEM法。
MD-VF-Auto SEM法以传统的硅藻检验方法为基础发展而来，其灵敏度高、结果可靠，是目前辅助溺死诊断的主要实验室依据[9 -10 ] 。但其所需设备较昂贵，对专业人员操作要求较高，在基层推广使用有一定困难。浮游生物基因复合扩增体系的优势在于可以检出除硅藻外的其他与溺死相关的浮游生物，且从检验过程来看，其操作简便，耗费时间更短。但随着尸体存放时间延长，尸体内的浮游生物DNA可能会降解，浮游生物基因复合扩增体系可能会出现假阴性结果。目前我国区级公安机关已经配备CE设备，浮游生物基因复合扩增体系更适用于大规模检测应用。当遇到疑难案件怀疑为溺死，浮游生物基因复合扩增体系检验结果阴性时，可采用MD-VF-Auto SEM法进一步确证。综上所述，基于硅藻形态学检验的MD-VF-Auto SEM法与浮游生物基因复合扩增体系各有优势，可在不同的应用场景中选择相应的方法进行溺死诊断分析，两者相结合可为溺死的诊断提供更加可靠的依据。
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2013
... 浮游生物中关于硅藻检验的研究较多.经典的硅藻检验方法一般先通过强酸消化法、胰蛋白酶消化法等去除组织中的有机质，然后富集组织消解液中的硅藻，在显微镜下根据硅藻的形态进行观察和分类[7 -10 ] .在此原理基础上，研发了微波消解-真空抽滤-自动扫描电子显微镜（microwave digestion - vacuum filtration - automated scanning electron microscopy，MD-VF-Auto SEM）法，其可靠性在多年来的实践中得到证实[9 -10 ] .近年来，以分子生物学技术检测浮游生物相关靶基因用于溺死诊断成为法医学领域的研究热点，并研发了一种包含12对特异性引物的浮游生物基因复合扩增体系[11 ] ，且具有良好的特异性和稳定性. ...
... MD-VF-Auto SEM法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9 -10 ] .相比反复的离心富集，0.45 μm孔径的滤膜（硅藻最小长度>1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16 ] ，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构.一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17 ] .本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%.尽管3种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异.肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1~10个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g.通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18 -20 ] .部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2~8个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21 ] 相似.通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17 -20 ] . ...
... MD-VF-Auto SEM法以传统的硅藻检验方法为基础发展而来，其灵敏度高、结果可靠，是目前辅助溺死诊断的主要实验室依据[9 -10 ] .但其所需设备较昂贵，对专业人员操作要求较高，在基层推广使用有一定困难.浮游生物基因复合扩增体系的优势在于可以检出除硅藻外的其他与溺死相关的浮游生物，且从检验过程来看，其操作简便，耗费时间更短.但随着尸体存放时间延长，尸体内的浮游生物DNA可能会降解，浮游生物基因复合扩增体系可能会出现假阴性结果.目前我国区级公安机关已经配备CE设备，浮游生物基因复合扩增体系更适用于大规模检测应用.当遇到疑难案件怀疑为溺死，浮游生物基因复合扩增体系检验结果阴性时，可采用MD-VF-Auto SEM法进一步确证.综上所述，基于硅藻形态学检验的MD-VF-Auto SEM法与浮游生物基因复合扩增体系各有优势，可在不同的应用场景中选择相应的方法进行溺死诊断分析，两者相结合可为溺死的诊断提供更加可靠的依据. ...
Application of the microwave digestion - vacuum filtration-automated scanning electron microscopy method for diatom detection in the diagnosis of drowning
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2015
... 浮游生物中关于硅藻检验的研究较多.经典的硅藻检验方法一般先通过强酸消化法、胰蛋白酶消化法等去除组织中的有机质，然后富集组织消解液中的硅藻，在显微镜下根据硅藻的形态进行观察和分类[7 -10 ] .在此原理基础上，研发了微波消解-真空抽滤-自动扫描电子显微镜（microwave digestion - vacuum filtration - automated scanning electron microscopy，MD-VF-Auto SEM）法，其可靠性在多年来的实践中得到证实[9 -10 ] .近年来，以分子生物学技术检测浮游生物相关靶基因用于溺死诊断成为法医学领域的研究热点，并研发了一种包含12对特异性引物的浮游生物基因复合扩增体系[11 ] ，且具有良好的特异性和稳定性. ...
... -10 ].近年来，以分子生物学技术检测浮游生物相关靶基因用于溺死诊断成为法医学领域的研究热点，并研发了一种包含12对特异性引物的浮游生物基因复合扩增体系[11 ] ，且具有良好的特异性和稳定性. ...
... MD-VF-Auto SEM法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9 -10 ] .相比反复的离心富集，0.45 μm孔径的滤膜（硅藻最小长度>1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16 ] ，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构.一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17 ] .本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%.尽管3种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异.肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1~10个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g.通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18 -20 ] .部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2~8个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21 ] 相似.通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17 -20 ] . ...
... MD-VF-Auto SEM法以传统的硅藻检验方法为基础发展而来，其灵敏度高、结果可靠，是目前辅助溺死诊断的主要实验室依据[9 -10 ] .但其所需设备较昂贵，对专业人员操作要求较高，在基层推广使用有一定困难.浮游生物基因复合扩增体系的优势在于可以检出除硅藻外的其他与溺死相关的浮游生物，且从检验过程来看，其操作简便，耗费时间更短.但随着尸体存放时间延长，尸体内的浮游生物DNA可能会降解，浮游生物基因复合扩增体系可能会出现假阴性结果.目前我国区级公安机关已经配备CE设备，浮游生物基因复合扩增体系更适用于大规模检测应用.当遇到疑难案件怀疑为溺死，浮游生物基因复合扩增体系检验结果阴性时，可采用MD-VF-Auto SEM法进一步确证.综上所述，基于硅藻形态学检验的MD-VF-Auto SEM法与浮游生物基因复合扩增体系各有优势，可在不同的应用场景中选择相应的方法进行溺死诊断分析，两者相结合可为溺死的诊断提供更加可靠的依据. ...
Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis
2
2021
... 浮游生物中关于硅藻检验的研究较多.经典的硅藻检验方法一般先通过强酸消化法、胰蛋白酶消化法等去除组织中的有机质，然后富集组织消解液中的硅藻，在显微镜下根据硅藻的形态进行观察和分类[7 -10 ] .在此原理基础上，研发了微波消解-真空抽滤-自动扫描电子显微镜（microwave digestion - vacuum filtration - automated scanning electron microscopy，MD-VF-Auto SEM）法，其可靠性在多年来的实践中得到证实[9 -10 ] .近年来，以分子生物学技术检测浮游生物相关靶基因用于溺死诊断成为法医学领域的研究热点，并研发了一种包含12对特异性引物的浮游生物基因复合扩增体系[11 ] ，且具有良好的特异性和稳定性. ...
... 本研究所使用的浮游生物基因复合扩增体系包含12对引物，不仅可检出9种硅藻，而且还可以检验出7种蓝藻和5种气单胞菌[11 ] ，这些都是水体中常见的水生生物，其体积更小，在溺死过程中更容易通过气-血屏障进入体循环.理论上，检出ND-A、ND-B 和UPA 表明存在硅藻，CBR 表明存在蓝藻，rPOD-A、rPOD-B、HLYA-A、HLYA-B、HLYA-C、AER-A、AER-B 和AER-C 表明存在气单胞菌.而本研究中浮游生物基因复合扩增体系在10个非溺死尸体的肺、肝、肾组织中均未检出以上12个基因座，这可能是由于无法在活体组织内存活，死亡后硅藻DNA降解，只有硅藻的硅质细胞壁被保留在组织内.浮游生物基因复合扩增体系有助于排除生前体内的硅藻沉积，只能检出进入组织的新鲜浮游生物.浮游生物基因复合扩增体系对50例溺死尸体肺、肝、肾组织的阳性率分别为92%、78%、76%，总阳性率为84%.肝、肾组织的阳性率和总阳性率均低于MD-VF-Auto SEM法（P <0.05）.虽然浮游生物基因复合扩增体系检验的浮游生物更多，但受限于取样量（0.5 g），使其阳性率低于MD-VF-Auto SEM法. ...
1
2020
... 收集广州市刑事科学技术研究所2020年5月—2021年5月鉴定的10例陆地上死亡的非溺死尸体（编号1~10号）和50例溺死尸体（编号11~60号）.溺死的诊断依据为通过案情调查或有目击者确认溺死，具有溺死的典型病理特征[5 ] ，排除镇静催眠类、有机磷类、毒品及灭鼠药类等常规毒（药）物中毒.非溺死案例的死因为颅脑损伤、机械性窒息和电击死.根据《法庭科学 硅藻检验技术规范 微波消解-真空抽滤-显微镜法》（GA/T 1662—2019）[12 ] 进行组织样本提取，样本置于-80 ℃冰箱冷冻保存以进一步检验.本研究由广州市刑事科学技术研究所批准. ...
1
2020
... 收集广州市刑事科学技术研究所2020年5月—2021年5月鉴定的10例陆地上死亡的非溺死尸体（编号1~10号）和50例溺死尸体（编号11~60号）.溺死的诊断依据为通过案情调查或有目击者确认溺死，具有溺死的典型病理特征[5 ] ，排除镇静催眠类、有机磷类、毒品及灭鼠药类等常规毒（药）物中毒.非溺死案例的死因为颅脑损伤、机械性窒息和电击死.根据《法庭科学 硅藻检验技术规范 微波消解-真空抽滤-显微镜法》（GA/T 1662—2019）[12 ] 进行组织样本提取，样本置于-80 ℃冰箱冷冻保存以进一步检验.本研究由广州市刑事科学技术研究所批准. ...
1
2018
... 硅藻是一种单细胞水生生物，广泛分布于各种自然水体，具有复杂的种群动态与生态学特征[13 ] .硅藻检验最广泛使用的方法是强酸消解、离心和光学显微镜观察.传统的硅藻检验方法由于灵敏度不高、具有一定的假阳性率，其辅助溺死诊断的价值受到一定程度的质疑[14 -15 ] . ...
1
2018
... 硅藻是一种单细胞水生生物，广泛分布于各种自然水体，具有复杂的种群动态与生态学特征[13 ] .硅藻检验最广泛使用的方法是强酸消解、离心和光学显微镜观察.传统的硅藻检验方法由于灵敏度不高、具有一定的假阳性率，其辅助溺死诊断的价值受到一定程度的质疑[14 -15 ] . ...
Diatom extraction with HCl from animal tissues：A technical note
1
2011
... 硅藻是一种单细胞水生生物，广泛分布于各种自然水体，具有复杂的种群动态与生态学特征[13 ] .硅藻检验最广泛使用的方法是强酸消解、离心和光学显微镜观察.传统的硅藻检验方法由于灵敏度不高、具有一定的假阳性率，其辅助溺死诊断的价值受到一定程度的质疑[14 -15 ] . ...
Evaluation of four digestive methods for extracting diatoms
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2007
... 硅藻是一种单细胞水生生物，广泛分布于各种自然水体，具有复杂的种群动态与生态学特征[13 ] .硅藻检验最广泛使用的方法是强酸消解、离心和光学显微镜观察.传统的硅藻检验方法由于灵敏度不高、具有一定的假阳性率，其辅助溺死诊断的价值受到一定程度的质疑[14 -15 ] . ...
微波消解-扫描电镜联用法在溺死诊断中的应用
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2012
... MD-VF-Auto SEM法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9 -10 ] .相比反复的离心富集，0.45 μm孔径的滤膜（硅藻最小长度>1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16 ] ，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构.一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17 ] .本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%.尽管3种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异.肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1~10个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g.通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18 -20 ] .部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2~8个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21 ] 相似.通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17 -20 ] . ...
微波消解-扫描电镜联用法在溺死诊断中的应用
1
2012
... MD-VF-Auto SEM法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9 -10 ] .相比反复的离心富集，0.45 μm孔径的滤膜（硅藻最小长度>1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16 ] ，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构.一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17 ] .本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%.尽管3种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异.肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1~10个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g.通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18 -20 ] .部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2~8个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21 ] 相似.通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17 -20 ] . ...
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2016
... MD-VF-Auto SEM法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9 -10 ] .相比反复的离心富集，0.45 μm孔径的滤膜（硅藻最小长度>1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16 ] ，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构.一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17 ] .本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%.尽管3种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异.肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1~10个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g.通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18 -20 ] .部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2~8个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21 ] 相似.通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17 -20 ] . ...
... [17 -20 ]. ...
2
2016
... MD-VF-Auto SEM法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9 -10 ] .相比反复的离心富集，0.45 μm孔径的滤膜（硅藻最小长度>1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16 ] ，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构.一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17 ] .本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%.尽管3种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异.肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1~10个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g.通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18 -20 ] .部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2~8个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21 ] 相似.通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17 -20 ] . ...
... [17 -20 ]. ...
A quantitative comparison analysis of diatoms in the lung tissues and the drowning medium as an indicator of drowning
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2016
... MD-VF-Auto SEM法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9 -10 ] .相比反复的离心富集，0.45 μm孔径的滤膜（硅藻最小长度>1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16 ] ，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构.一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17 ] .本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%.尽管3种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异.肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1~10个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g.通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18 -20 ] .部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2~8个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21 ] 相似.通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17 -20 ] . ...
Correlation analysis of diatom content in the organs and drowning mediums for the drowning death cases
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2021
Evaluation of L/D ratio in a water-related case for the differentiation between drowning and postmortem immersion
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2019
... MD-VF-Auto SEM法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9 -10 ] .相比反复的离心富集，0.45 μm孔径的滤膜（硅藻最小长度>1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16 ] ，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构.一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17 ] .本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%.尽管3种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异.肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1~10个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g.通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18 -20 ] .部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2~8个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21 ] 相似.通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17 -20 ] . ...
... -20 ]. ...
Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning -- Would not be an impediment
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2019
... MD-VF-Auto SEM法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9 -10 ] .相比反复的离心富集，0.45 μm孔径的滤膜（硅藻最小长度>1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16 ] ，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构.一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17 ] .本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%.尽管3种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异.肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1~10个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g.通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18 -20 ] .部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2~8个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21 ] 相似.通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17 -20 ] . ...
