硅藻用于溺死诊断已有百余年的历史^[1]，被认为是溺死诊断的可靠依据^[2]。关于硅藻检验方法的研究很多，主要目的是增强有机质消解能力，提高硅藻回收数量^[3-10]。微波消解-真空抽滤-扫描电子显微镜法是一种基于膜富集的高效硅藻检验方法^[11]，该方法主要由三个步骤组成，即通过微波辐射加热消解组织的有机质、通过负压抽滤将硅藻富集于微孔膜和在高分辨率的扫描电子显微镜下观察硅藻，具有硅藻检出数量多、回收数量高、溺死诊断阳性率高等特点^[1,5,11-12]。但是，在法医学实践中由于缺少对微波消解温度和时间的研究数据，造成各实验消解程序不同、消解效果不一。

因此，本研究以微波消解-真空抽滤-扫描电子显微镜法为基础，探索不同消解温度和不同消解时间对硅藻检验结果的影响。

65%浓硝酸溶液、30%过氧化氢溶液（德国Merck公司），无水乙醇（广州化学试剂厂），Y220一次性抽滤杯（内含滤膜）、法医硅藻检验操作台（由X-8微波消解仪和SFI-06真空抽滤仪等组成；珠海市祥臻生物科技有限公司），SCD005离子溅射仪（德国Leica公司），Phenom XL G2台式扫描电子显微镜（荷兰PhenomWorld公司），XS105分析天平[梅特勒托利多科技（中国）有限公司]。

选择广州市刑事科学技术研究所非溺死案件尸体2例，均死因明确、未见肝疾病。各提取肝组织100 g，共200 g；提取珠江广州市区段水样1 000 mL，将肝组织分为80份，每份2 g，每份肝组织与2 mL珠江水混合，往每份肝组织与水样的混合物中分别加入8 mL 65%浓硝酸溶液和2 mL 30 %过氧化氢溶液。40份用于研究消解温度对硅藻检验的影响，另外40份用于研究消解时间对硅藻检验的影响。实验遵循《赫尔辛基宣言》原则，经广州市刑事科学技术研究所批准。

40份样本按消解温度100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃、180 ℃平均分为5组，每组8份，每组消解时间均为60 min，使用微波消解-真空抽滤-扫描电子显微镜法进行硅藻检验。简要步骤如下：

（1）微波消解。将样品置于消解管内，加入8 mL 65%浓硝酸溶液和2 mL 30%过氧化氢溶液，然后置于X-8微波消解仪中进行消解。消解程序设置为工作功率1 000 W，工作压力30 kg/cm²，消解时间设60 min，冷却时间60 min，消解温度分别为100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃、180 ℃；消解完成后，取出消解管，向管内加入50 mL超纯水稀释消解液的酸度。

（2）滤膜富集。将消解液倒入Y220一次性抽滤杯内进行抽滤。SFI-06真空抽滤仪的抽滤效率设置为100%。抽滤前先加入120 mL超纯水于滤杯中，再将消解液倒入滤杯中抽滤，抽滤完成后加10 mL无水乙醇去除滤膜内水分。取出滤膜晾干，将滤膜贴于样品座上，使用SCD005离子溅射仪喷镀金膜后用Phenom XL G2台式扫描电子显微镜分析。

（3）扫描电子显微镜分析。在Phenom XL G2台式扫描电子显微镜（加速电压10 kV，图片像素为1 920×1 147）下将放大倍数设置为800×，选择随机拍摄5%的滤膜面积，约100个视场，自动拍摄每个视场照片。

40份样本按消解时间为40、50、60、70、80 min平均分为5组，每组8份，使用微波消解-真空抽滤-扫描电子显微镜法进行硅藻检验。简要步骤如下：

（1）微波消解。将样品置于消解管内，加入8 mL 65%浓硝酸溶液和2 mL 30% 过氧化氢溶液，然后置于X-8微波消解仪中进行消解。消解程序设置为工作功率1 000 W，工作压力30 kg/cm²，消解温度140 ℃（由1.2.1节消解温度对硅藻检验的影响实验得到），消解时间分别为40、50、60、70、80 min，冷却时间设置为60 min；消解完成后，取出消解管，向管内加入50 mL超纯水稀释消解液的酸度。

（2）滤膜富集。同1.2.1节（2）步骤。

（3）扫描电子显微镜分析。同1.2.1节（3）步骤。

将扫描电子显微镜分析得到的约100个视场中的硅藻由2位从事硅藻检验的法医分别观察硅藻破碎情况，并进行人工计数（体积超过一半的碎片算完整硅藻），取平均值以减少误差。将所得硅藻数量除以视场所占百分比得到富集于滤膜上的硅藻数量，即回收数量。

在XS105分析天平上称量滤膜质量，富集硅藻之后滤膜的质量减去富集硅藻之前滤膜的质量即为滤膜上残留物质量，用于评价微波消解系统对组织的消解能力，滤膜上残留物质量越低表明微波消解系统对组织的消解能力越强，反之消解能力则越弱。

所有数据以均值±标准差（x¯±s）表示，对符合正态分布且具有方差齐性的数据进行单因素方差分析，单因素方差分析后结果的进一步两两比较采用Student-Newman-Keuls（SNK法）分析。对不符合上述两个条件的数据进行独立样本Kruskal-Wallis检验，Kruskal-Wallis检验后数据的两两比较采用Kruskal-Wallis检验下的成对比较。采用SPSS 25.0软件（美国IBM公司）进行统计学分析，检验水准α=0.05。

当消解时间固定在60 min时， 100 ℃、120 ℃、140 ℃的硅藻的回收数量分别与180 ℃之间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。在140 ℃以下，硅藻回收数量随着消解温度的增加而呈增加趋势；当消解温度达到140 ℃时，增加消解温度，硅藻的回收数量开始降低（表1）。

根据2.1.1的结果设置了在140 ℃下的5个消解时间。不同消解时间的硅藻回收数量之间差异均有统计学意义（P<0.05），但40、50、60 min之间的硅藻回收数量之间差异无统计学意义（P>0.05）。当消解时间为40 min时，硅藻的回收数量为（20 650.88±1 950.27）个，当消解时间到80 min时，硅藻的回收数量仅为（16 284.25±1 777.11）个（表2），硅藻回收数量随着消解时间的延长而降低。方差分析结果（表2）显示，当消解温度为140 ℃时，在设定的时间范围内随着消解时间的增加，硅藻的回收数量呈逐渐降低的趋势。

在消解时间为60 min时，滤膜上的残留物质量在100 ℃、120 ℃、140 ℃与180 ℃消解温度之间差异均有统计学意义（P<0.05），滤膜上的残留物质量在100 ℃、120 ℃与160 ℃消解温度之间差异均有统计学意义（P<0.05）（表3）。根据表3可以看出，当消解时间一定时，在设立的温度范围内，随着消解温度的升高，滤膜上的残留物质量呈现降低趋势。

根据2.1.1的结果设置在140 ℃下的5个消解时间（表4），随着消解时间的增加，滤膜上的残留物质量有减少趋势，但各组滤膜上的残留物质量之间差异无统计学意义（P>0.05）。

硅藻是一种单细胞真核藻类，其细胞壁由上下两个半壳套在一起形成，上下两个面称壳面，侧面套合的部分称壳环，其组合形似一个盒子的盒体和盖子^[1,13]。硅藻检验对法医学诊断溺死及推断溺死地点具有重要意义^[14-15]。微波消解-真空抽滤-扫描电子显微镜法是一种较好的硅藻检验方法，其中微波消解的工作原理是当微波通过样品时，引起极性分子和带电粒子伴随微波频率快速运动。微波消解仪使用的频率基本为2 450 MHz，在这样的频率下，分子每秒变换2.45×10⁹次方向，分子的来回运动与周围分子相互碰撞摩擦，产生热量使样品温度升高^[1]。微波在加热的过程中可以穿透样品内部，使整个样品的各个部分同时产生热效应，加热快速、均匀，大大缩短了加热时间，并且微波加热可直接作用到物质内部，提高能量的利用率^[1]。另外极性分子和带电粒子在电磁场中快速运动，使试剂与样品表面的接触更充分，交变电磁场相当于高速搅拌器，提高了化学反应的速率，使得消解速度更快^[1]。本研究以微波消解法为基础研究硅藻检验过程中消解时间和消解温度对硅藻检验结果的影响，发现消解时间60 min时硅藻的回收数量随着消解温度的升高，呈现先升高再降低的趋势。硅藻回收数量升高的原因可能是由于温度的升高，一些硅藻的壳环或连接处被打开，导致硅藻的数量增加。当消解温度升高到140 ℃时，硅藻的回收数量可高达（28 797.50±6 009.67）个。在这个温度下，可能所有的硅藻壳面都已分开或者连接处全部断裂。而当温度再升高时，一些耐受不了高温的硅藻就被破坏，导致硅藻回收数量下降。

于消解温度140 ℃时，硅藻的回收数量随着消解时间的增加呈现下降的趋势。其可能原因是随着消解时间的增加，一些硅藻无法耐受长时间高温而碎裂，对方差分析后的结果进行两两比较，结果表明消解时间为40、50、60 min比较适合组织消解。

当消解时间为60 min时，随着消解温度的增加，滤膜上的残留物质量呈降低的趋势。这说明当消解时间一定时，随着消解温度的增加，消解能力越来越强。其产生的可能原因是随着消解温度的增加，在微波的作用下，组织内的分子运动加快，分子之间的碰撞摩擦速度也增加，反应速度加快。与此同时，温度的增加，意味着热能的增加，能量作用于组织样品，增加了反应的速度。另一个可能原因是，消解罐内是一系列的化学反应，随着反应温度的增加化学平衡向生成消解液的方向移动，单位时间内化学反应速率加快。因此在相同的消解时间内，随着消解温度的增加滤膜上的残留物质量呈现减小的趋势。

当消解温度为140 ℃时，随消解时间的增加，滤膜上的残留物质量的变化无统计学意义（P>0.05），尚不能说明随着消解时间的增加，消解能力越强。产生这种情况的可能原因是，当消解温度一定时，消解罐内的分子运动、分子之间的碰撞以及单位时间内所获得的热量都没有发生改变，消解罐内化学反应的速率也没有发生显著改变，随着反应时间的增加，反应的底物会随着反应的进行而有一定的减少，但减少的量并没有温度升高时明显。因此，在表4中可以看到随着消解时间的增加，滤膜上的残留物质量有减小的趋势，但各组滤膜上的残留物质量之间差异无统计学意义（P>0.05）。

在进行硅藻检验时，消解时间为60 min时，随着消解温度增加，热量逐渐超过硅藻的耐受限度，最终导致硅藻回收数量下降，而硝酸对组织的消解能力增强。消解温度为140 ℃时，随着消解时间增加，超过硅藻对热的耐受时限，导致硅藻回收数量下降，但硝酸对组织的消解能力未见增强。综上所述，当消解温度为140 ℃，消解时间为40、50、60 min利于硅藻检出。