法医学杂志, 2023, 39(1): 50-56 DOI: 10.12116/j.issn.1004-5619.2021.410602

综述

基于眼组织结构的死亡时间推断研究进展

吴慧,1,2, 刘芳芳1, 伍俊达3, 谢英,1

1.川北医学院法医学系,四川 南充 637000

2.宜宾市第二人民医院,四川 宜宾 644000

3.宜宾市公安局叙州区分局,四川 宜宾 644000

Research Progress on Estimation of Postmortem Interval Based on Ocular Tissues Structure

WU Hui,1,2, LIU Fang-fang1, WU Jun-da3, XIE Ying,1

1.Department of Forensic Medicine,North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,Sichuan Province,China

2.The Second People’s Hospital of Yibin,Yibin 644000,Sichuan Province,China

3.Xuzhou District Branch of Yibin City Pubic Security Bureau,Yibin 644000,Sichuan Province,China

通讯作者: 谢英,女,硕士,副教授,主要从事法医学教学、科研和鉴定;E-mail:xieying1024@126.com

编委: 张建华

收稿日期: 2021-06-10  

基金资助: 四川省基层卫生事业发展研究中心资助项目.  SWFZ17-Z-12
四川省教育厅基金资助项目.  15ZA0215
南充市市校合作科研专项资助项目.  19SXHZ0197

Received: 2021-06-10  

作者简介 About authors

吴慧(1995—),女,硕士研究生,主要从事法医学研究;E-mail:377894385@qq.com

摘要

死亡时间(postmortem interval,PMI)推断是法医病理学研究的重点与热点问题。近年来,国内外学者利用眼组织推断PMI取得了一定进展,机体死后眼角膜、房水、虹膜、晶状体、玻璃体液、视网膜等改变均呈现与PMI高度相关的时序性变化规律。本文基于眼组织不同结构死后形态学、生物化学、分子学、遗传物质改变等方面,对PMI推断研究进展进行了综述,对存在的问题及发展趋势进行探讨。

关键词: 法医病理学 ; 死亡时间 ; 眼组织 ; 角膜 ; 玻璃体液 ; 综述

Abstract

Estimation of postmortem interval (PMI) is one of the important research contents in forensic pathology, and it has always been the focus and hot spot of research work. In recent years, scholars at home and abroad have made some research progress in estimating PMI by using ocular tissue. After death, the changes of cornea, aqueous humor, iris, lens, vitreous humor and retina all show time sequence change rule highly related to PMI. This paper reviews the research progress of PMI estimation based on the morphological, biochemical, molecular and genetic material changes of different ocular tissue structures after death, and discusses the existing problems and development trends.

Keywords: forensic pathology ; postmortem interval ; ocular tissues ; cornea ; vitreous humor ; review

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本文引用格式

吴慧, 刘芳芳, 伍俊达, 谢英. 基于眼组织结构的死亡时间推断研究进展. 法医学杂志[J], 2023, 39(1): 50-56 DOI:10.12116/j.issn.1004-5619.2021.410602

WU Hui, LIU Fang-fang, WU Jun-da, XIE Ying. Research Progress on Estimation of Postmortem Interval Based on Ocular Tissues Structure. Journal of Forensic Medicine[J], 2023, 39(1): 50-56 DOI:10.12116/j.issn.1004-5619.2021.410602

德国学者Hensage C提出的基于尸体现象的综合参数法[1]已在法医病理学实践中得到一定应用,但其准确性与应用范围仍然无法满足案件需要。相关物理学、生物化学、代谢组学、光谱学及分子生物学方法均被应用于研究死亡时间(postmortem interval,PMI)推断,是近年来国内外研究的热点[2-6],但受限于准确度、变异度、操作复杂度以及使用成本等因素,至今尚无公认、简易实用、准确可靠的推测方法[7]。眼组织是人体相对较为独立的组织,研究[8]表明,死后眼球各层结构存在时序性变化规律,并与PMI高度相关。本文基于眼组织推断PMI的法医学研究进展进行综述,探讨其在PMI推断中的法医学价值。

1 角膜与PMI推断

角膜位于眼球壁最外层,由高度有序排列的细胞和蛋白质构成,无血管分布[9]。正常生理状态下,角膜无色、透明,疾病、创伤等病理状态下,角膜透明度会发生改变。研究[10]表明,机体死后角膜混浊度、厚度及内皮细胞活性等改变与PMI有很好的相关性。

1.1 角膜混浊度与PMI推断

机体死后新陈代谢停止,角膜机械性屏障功能消失,随着PMI延长,角膜内皮细胞发生凋亡,大量水分透过角膜内皮层渗入角膜基质层,导致角膜内糖胺聚糖水合作用受阻,角膜出现混浊,其程度与PMI高度相关[11]。根据角膜混浊程度推断PMI是法医病理学实践中的经典方法之一,但角膜混浊在机体死亡24 h内呈阶段性改变,24 h后很难通过肉眼观察其变化,目前尚无对角膜混浊程度及PMI准确定量的分析方法[12],但计算机角膜图像分析技术及人工智能(artificial intelligence,AI)[13]的引入不失为一种客观评价角膜混浊程度及其与PMI规律的新方法。

计算机角膜图像分析技术是从角膜图像中提取不同PMI角膜的颜色和纹理特征,采用计算机机器学习系统进行分析处理,可明确角膜混浊与PMI的变化规律[14]。2010年,ZHOU等[15]在角膜图像分割方法的基础上通过高清数码摄像机连续原位拍摄兔死后48 h内不同时间点的角膜图像,采用K近邻(K-nearest,KNN)算法对所有图片进行分类计算,并用4个颜色特征参数(灰度特征、平均值、方差、偏度)和5个纹理特征参数(低频能量和高频能量的比值、对比度、熵、相关性、能量)来描述图像特征与PMI的关系,结果表明,单一特征预测PMI准确度不高,但将9种特征参数组合推断PMI精确度显著提高,结论可靠有效。

2021年,ZHENG等[16]采用自主设计开发的内置专用图像分析系统的智能手机,在特定光源条件下捕捉猪死后72 h内角膜瞳孔区域6个颜色特征参数(红、绿、蓝、色调、饱和度、亮度)和4个纹理特征参数(对比度、相关性、角秒矩、均匀度),建立PMI模型并进行分析,结果显示,红和对比度与PMI高度正相关,回归方程分别为:y=-0.083 6x2+5.513 7x-11.459(R2=0.955),y=-0.187 4x2+9.630 3x-46.767(R2=0.983);该研究还利用对比度与PMI的数据模型对未知样本预测精度进行了评价,结果表明,死后36 h内的预测误差小于3 h,但36 h后误差范围在6~8 h。

1.2 角膜厚度与PMI推断

角膜厚度与PMI的正相关关系早在1723年就被VONBAHR[17]发现,但当时角膜厚度测量仅限于解剖学方法,且存在误差。2001年,孟祥志等[18]采用光学显微镜测量兔死后48 h内角膜厚度,发现其与PMI呈正相关,但该方法需对角膜进行病理切片处理,制片过程会对角膜厚度产生影响。2008年,朱少华等[19]用透射电镜观察家兔死后72 h内角膜中央区域内胶原纤维变化,经图像分析系统测量角膜基质胶原纤维的横截面面积、周长、平均直径、等效直径4个参数,结果显示,随PMI延长,这4个参数值均逐渐增加,胶原纤维直径逐渐增大,这4个参数有望成为PMI推断的新指标。

2012年,吕国丽等[20]利用超声角膜测厚仪对机体死后24 h内角膜厚度进行原位动态监测,结果显示,角膜上皮完整组角膜厚度与PMI呈高度正相关性,而去角膜上皮组角膜厚度与PMI相关性则相对较差。由于死后24 h角膜上皮逐渐脱落会导致角膜厚度改变,尤其在法医学实践中,当尸体暴露在野外且眼睑处于持续张开状态时,角膜上皮更容易脱落,因此利用角膜厚度推断PMI应注意角膜上皮的完整性,审慎分析检测结果与PMI的关系。

NAPOLI等[21-22]分别在2016年、2018年利用便携式光学相干断层成像(optical coherence tomography,OCT)测量并分析了绵羊死后角膜中央厚度(central corneal thickness,CCT)的变化规律,结果显示,死后CCT测量的重复性和重现性较好,说明便携式OCT是原位角膜厚度测量的可靠工具。2020年,NAPOLI等[23]在前述研究的基础上,利用OCT对人死后CCT进行测量,进一步验证了OCT检测角膜厚度具有很好的重复性和重现性。此外,他们还发现人死后角膜厚度在睁眼或闭眼模式下表现出相反的变化规律,睁眼时CCT值逐渐减小,而闭眼时CCT值逐渐增加,角膜中央厚度的变化值百分比(△CCT%)在睁眼和闭眼模式下分别为-(21.495±16.202) μm和(16.981±15.580) μm,这些差异可能与组织脱水以及眼睛在未受眼睑保护时的泪液蒸发有关。

1.3 角膜内皮细胞与PMI推断

角膜内皮细胞结构较单一,位于角膜最内层,受外界影响较小且易于染色观察,生理上起着维持角膜正常厚度和透明度的作用[8],机体死亡后,角膜内皮细胞活性变化及DNA含量变化与PMI有一定关联性。

1.3.1 角膜内皮细胞活性率与PMI推断

1995年,宋国林等[24]采集了死后24 h内已知PMI的人眼角膜,对角膜内皮细胞进行锥兰联合茜素红染色,镜下观察并计算失活细胞数目,发现角膜内皮细胞活性率与PMI呈明显负相关。1999年,徐长苗等[25]建立了1~10 ℃、11~20 ℃、21~30 ℃环境温度下角膜内皮细胞活性变化特征参数的反S曲线数学模型,该模型显示,角膜内皮细胞活性与PMI相关系数高达95%,且环境温度越高,尸体角膜内皮细胞活性率越低,根据角膜内皮细胞活性率检测结果推算24 h内PMI,是较好的量化参数模型,为早期PMI推断提供了新的手段。2014年,李晓娜等[26]对死后72 h内的兔角膜内皮细胞采用茜素红-曲利苯兰联合染色法进行观察,发现角膜内皮细胞活性率随PMI的延长呈下降趋势,与PMI具有较强的负相关性(r为0.903 2,R2为0.815 7)。

1.3.2 角膜DNA含量与PMI推断

由于角膜本身无血管,能避免管腔内溶解酶对DNA降解的影响,从而保持细胞核内DNA的稳定性。2003年,刘承泉等[27]研究发现,家兔死后不同时间点角膜上皮和内皮细胞核DNA降解率与PMI呈明显正相关。2010年,郑吉龙等[28]等利用单细胞凝胶电泳技术结合计算机图像分析技术检测兔死后0~48 h角膜内皮细胞核DNA降解与PMI的变化规律,结果显示,兔死后角膜内皮细胞产生彗星现象,且彗星样细胞出现率于兔死后6 h逐渐增加,且与PMI呈正相关。

2 房水与PMI推断

房水是充满眼前、后房的透明液体,位于角膜后部、晶状体前部,具有流动性。房水内相关离子浓度变化有助于推断PMI。2010年,韩菊等[29]利用分光光度计检测猪死后4 ℃、28 ℃下48 h内房水中钾离子(K+)、钠离子(Na+)的浓度,发现随PMI延长,K+呈上升、Na+呈下降趋势,且低温环境(4 ℃)下猪房水中K+、Na+浓度变化与PMI具有显著相关性。

2010年,吕国丽等[30]发现,房水中K+浓度变化与PMI高度相关,而Na+、钙离子(Ca2+)与PMI相关性不明显。

相对于玻璃体液而言,房水采样简单易抽取,呈非胶冻状,其内具有极低成分蛋白质和脂质,不但简化样品准备过程,还避免左右眼质量浓度差异,减小了可能的实验误差[30],具有一定研究价值。但房水量少且易渗透,温度较高情况下会加剧腐败和渗透,导致房水消失,因此房水仅适合于低温下或死后早期PMI推断。

3 虹膜与PMI推断

虹膜是位于角膜与晶状体之间的一层色素膜,2008年,ABRAHAM等[31]发现,猪死后虹膜颜色随PMI的延长而变化,但颜色变化基于主观观察,误差较大。由于机体死亡后,失去虹膜瞳孔括约肌的支配作用,瞳孔呈散大改变,因此有研究人员利用瞳孔直径的变化推断PMI,其中一项技术是基于瞳孔的药理学反应。2016年,LARPKRAJANG等[32]通过对100例已知PMI在24 h内的尸体检验病例采用游标卡尺测量瞳孔直径后,应用药物滴眼,10 min后再次测量瞳孔直径,对滴眼液使用前后瞳孔直径的差异进行回归分析,结果显示,随着PMI延长瞳孔直径差减小。但2018年,KOEHLER等[33]认为,使用药物滴眼后瞳孔-虹膜直径比例的变化是死后瞳孔自发变化,而不是死亡机体对药物的刺激反应,说明使用瞳孔的药理学反应作为评估PMI的方法尚有争议,不仅缺乏统计上有意义的证据支持,瞳孔测量的可靠性也有待证实[34]

4 晶状体与PMI推断

晶状体位于虹膜与玻璃体之间,无血管、透明且富有弹性。2015年,PRIETO-BONETE等[35]通过提取40只兔的晶状体(n=80),将其分为死后24、48、72、96 h组,利用紫外分光光度计及数字图像处理测定其在365、370、375、415、420 nm处的吸光度和球度,对提取的晶状体行病理切片及染色,发现兔死后24 h和48 h晶状体仍保持透明,72 h后透明度下降,96 h时完全不透明甚至失去了球度;另外,随着PMI延长,晶状体吸光度和球度均呈下降趋势,且晶状体结构和组织成分也随PMI延长而逐渐瓦解。由于晶状体被保护在房水和玻璃体液之间,所以晶状体的变化被认为是死亡晚期发生的,对PMI较长的尸体,具有一定推断价值。

5 玻璃体液与PMI推断

5.1 玻璃体液中离子浓度与PMI推断

由于机体死后细胞膜通透性被破坏,K+溢出至细胞外,致玻璃体中K+浓度随PMI延长呈增加趋势[36]。2010年,吕国丽等[30]研究发现,玻璃体液中K+浓度与PMI有一定相关性,但相关性(r=0.525)不如房水中K+浓度(r=0.956)明显。2015年,ZILG等[37]发现,462例死后2 h~17 d人玻璃体液中K+浓度呈非线性上升曲线,且受死者年龄和环境温度影响较小。2016年,FOSTER等[38]的研究结果表明,6~162 h人玻璃体液中K+浓度与PMI呈线性增长关系,其回归方程为PMI=6.42[K+]-40.94(R=0.67)。上述研究表明,玻璃体液中K+浓度变化对PMI推断具有很好的应用前景。2020年,MIHAILOVIĆ等[39]采集人死后24 h内玻璃体液标本进行分析,结果显示,随着PMI延长,Ca2+浓度呈上升趋势,建立了Ca2+与PMI的数学模型PMI=[Ca2+]×13.696-7.834(r=0.398)。

5.2 玻璃体液中其他代谢产物与PMI推断

ZELENTSOVA等[40]研究发现,与血清相比,玻璃体液和房水的代谢组学分析更适合PMI推断,且玻璃体液中几种代谢物浓度与PMI相关性略强于房水。FOCARDI等[41]通过测定人死后玻璃体液内Na+、K+、氯离子(Cl-)、镁离子(Mg2+)、尿素氮、尿酸、葡萄糖和肌酐以及白蛋白浓度发现,只有K+、白蛋白与PMI具有显著相关性。GO等[42]对人死后13~103 h玻璃体液中的次黄嘌呤及乳酸含量进行定量分析,并按照死后不同季节(春、夏、秋、冬)对样品进行分类。结果显示,随PMI延长,乳酸和次黄嘌呤浓度增加,且冬季次黄嘌呤和乳酸与PMI的相关性最好。陶涛等[43]利用自动生化仪对人死后0.5~216 h的126例玻璃体液中11种化学成分的含量进行测定,结果显示,玻璃体液中葡萄糖、Na+、Cl-随PMI的延长而逐渐下降,尿素、肌酐、尿酸、K+、Ca2+、Mg2+、无机磷、微量蛋白随PMI延长而逐渐升高。其中葡萄糖(r=-0.824)、K+r=0.967)和无机磷(r=0.880)与PMI相关性好,而尿酸和微量蛋白不适于PMI推断。

5.3 玻璃体液中分子变化与PMI推断

2018年,ZHANG等[44]通过采集72只兔死后0~48 h(间隔时间6 h)内的玻璃体液,用傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)进行检测,通过分析样本在1 800~900 cm-1范围内光谱吸收峰强度和峰形变化规律,来确定玻璃体液中蛋白质、核酸、碳水化合物等成分分子变化与PMI的关系。该研究建立了贝叶斯岭回归(Bayesian ridge regression,BRR)、支持向量回归(support vector regression,SVR)和人工神经网络(artificial neural network,ANN)3种数学模型,结果显示,ANN方法预测PMI精确度最高(R2=0.981),误差为2.018 h,从而证实了基于玻璃体液的FTIR技术对PMI推断估计具有很高的潜力。

6 视网膜与PMI推断

6.1 视网膜DNA或RNA与PMI推断

利用视网膜推断PMI是近年的研究新热点,由于视网膜处于相对密闭的眼组织最内层,受外界干扰小,DNA或RNA降解速度相对较慢,被认为是研究DNA或RNA降解与早期PMI关系的良好检材。2009年,彭新等[45]检测0~28 h鼠视网膜核积分光密度(integral optical density,IOD)、平均光密度(average optical density,AOD)及异形指数(index of density,ID),结果显示,视网膜细胞核AOD和IOD随PMI延长逐渐下降,ID则呈上升趋势。28 h内各参数变化的回归方程为YAOD=-0.009XAOD+0.590(R2=0.949)、YIOD=-0.097XIOD+18.903(R2=0.968)、YID=0.122XID+2.246,(R2=0.951)。2010年,方超等[46]同样发现,猪死后24 h内(间隔时间2 h),随PMI延长猪视网膜细胞核呈规律性降解,DNA含量与PMI回归方程为y=92.227-5.188x+0.019x2+0.001x3R2=0.971)。

陈晓瑞等[47]应用复合荧光RT-PCR技术检测大鼠死后28 h内视网膜细胞3个管家基因(β-actinPgk1Rpl4)的mRNA水平,发现3个管家基因mRNA的水平均随PMI延长而下降,与PMI的回归方程分别为

Yβ-actin =-4 436.205Xβ-actin +127 581.7(R2=0.976),

YPgk1 =-1 993.884XPgk1 +57 651.54(R2=0.973),

YRpl4 =-1 189.791XRpl4 +34 533.46(R2=0.955)。

6.2 视网膜血管图像与PMI推断

2019年,李晓娜等[48]应用检眼镜来获取兔死后9 h内视网膜血管图像,发现兔死后2 h内视网膜血管形态变化不明显,死后3~8 h内眼底血管呈从外周向视盘逐渐消退趋势,至死后9 h血管完全消失。但视网膜血管图像变化与PMI推断的研究目前既缺乏客观量化依据,也未能明确是否受到角膜透明度下降致眼底窥视清晰度不佳的影响,眼底血管变化与PMI的关系有待深入研究。

7 小结与展望

综上所述,除利用传统形态学改变推断PMI外,上述生物化学、代谢组学、光谱学或分子生物学等各种研究揭示角膜、房水、虹膜、晶状体、玻璃体、视网膜等各层眼组织结构死后变化都与PMI高度相关。眼组织是人体相对独立的组织器官,有望成为PMI推断的理想检材,如角膜易于直观观察,玻璃体液和房水易取材且无创,视网膜受污染小、化学成分相对稳定等[49]。这些特有优势,使基于眼组织的PMI推断具有很好的法医学研究前景及实践应用价值。

综合前述研究结果,眼组织与PMI关系研究尚存在以下问题:(1)大部分研究数据来源于动物实验,动物模型死因、环境条件均相对单一,尚缺乏人体样本数据。(2)尽管一些眼组织与PMI推断具有高度相关性,如晶状体透明度变化有利于死后72~96 h的PMI推断,视网膜遗传物质降解程度在死后24~28 h内具有良好相关性并可以用回归方程进行量化,但样本获取需破坏眼球结构,甚至影响尸体遗容,在实际运用中有一定局限性。(3)利用部分标志物建立的回归方程或数学模型尚不完全一致,重复性仍有待进一步提高。(4)部分回归方程或数学模型采用的指标较单一,多方法、多代谢产物、多遗传标记物联用较少,推断PMI的准确性仍有待提高。

寻求便携、简便、无创(微创)、准确的PMI推断方法仍任重而道远,总体而言,基于眼组织的PMI推断在以下方面值得进一步研究:(1)基于角膜形态学改变的计算机成像、AI数据模型研究。计算机成像系统、便携式角膜测厚仪、便携式OCT等研究方法操作简便、不破坏眼球,使尸体角膜颜色或厚度变化在人体原位的精确捕捉或准确测量能得以实现,进一步积累、完善角膜图像数据以提高计算机预测模型的可靠性和有效性有良好的应用前景。随着角膜图像自动识别、便携式智能设备进一步开发,仅通过一台带有智能图像分析系统的便携式设备就能采集死后角膜图像并自动准确分析PMI有望成为现实。(2)基于角膜或玻璃体分子组成改变的无创(微创)研究。FTIR能准确、高效、无损地确定物质结构和分子组成,利用FTIR技术结合化学计量学方法有望建立更精确的PMI数学推断模型,从分子角度推断PMI[50-51]。便携式红外光谱仪的开发以及相关数据的不断积累,有望仅通过现场原位采集角膜、甚至整个眼球的红外光谱数据就能快捷地推断PMI。(3)基于房水及玻璃体液中代谢组学的研究。目前,单一离子浓度或代谢产物在房水或玻璃体液中的死后变化规律已经取得一定研究成果,但近年来兴起的代谢组学研究,为明确死后机体内各类代谢产物的变化特点、寻找稳定可靠的新生化指标以及建立准确的多指标联合数学模型提供了新思路,有望成为PMI推断的研究热点之一。(4)基于角膜或视网膜微创遗传物质降解研究。利用遗传物质降解规律推断早期或晚期PMI已取得很大进展[52],但基于眼组织结构的遗传物质降解规律研究仅限于实验动物阶段,取得的研究结果提示,建立人体数据很有必要且应用前景良好。随着微创取材技术的发展,基于角膜或视网膜的遗传物质降解研究、选择合适的遗传标志物很有可能成为新的研究热点。

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