表观遗传学是与遗传学相对应的概念，是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及染色质重塑等。表观遗传修饰在个体发育衰老的过程中发挥着重要作用，其对个体组织和细胞的影响陪伴其终生^[1]。相比组蛋白修饰和染色质重塑，DNA甲基化所含信息量丰富且对DNA含量具有高敏感度，因而具有很高的法医学应用价值^[2]。DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶将甲基基团添加到胞嘧啶环的C-5位置对DNA进行共价修饰，导致DNA构象变化，从而影响蛋白质与DNA的相互作用，且甲基化程度与基因表达水平呈负相关。甲基化和去甲基化过程不仅对转录调控很重要，在发育和细胞分化过程中也起着至关重要的作用，是造成个体表型差异的重要原因之一^[3-5]。随着检测技术的提高，DNA甲基化在法医学中的应用越来越广泛，有望作为法医学DNA序列相关遗传标记的有效补充，为司法鉴定或刑事侦查中个体年龄推断、组织体液来源鉴定等提供相关信息^[6-8]。本文从DNA甲基化角度出发，总结其用于年龄推断的研究进展，为进一步建立可用于法医学鉴定实践的年龄推断模型提供参考。

1973年，VANYUSHIN等^[9]以大鼠心、脑、脾、肺、肾等器官为研究对象对DNA中GC含量和5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-MeCyt）进行研究，首次报道了DNA甲基化整体水平随着年龄而变化，重点探讨了DNA中5-MeCyt含量的组织特异性，发现随年龄的增加5-MeCyt的含量在大脑、心脏和脾中降低，而在肝、肺中没有改变，在肾中则有略微的增加。在同卵双胞胎之间开展的流行病研究也证实了表观遗传修饰在年长个体之间更容易出现差异^[9-12]，由此提出了“表观遗传漂移（epigenetic drift）”假说。这一假说认为，随着细胞分裂，DNA甲基化的保守性逐渐降低^[13]。后续研究也表明，不同物种中多个胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（cytosine phosphate guanine，CpG）位点的甲基化修饰程度与衰老过程显著相关，例如，一些抑癌基因和靶基因的甲基化程度随着年龄增长而增强^[14]。最近20年间，随着芯片技术和高通量测序技术的飞速发展，有研究^[15-16]检测了全基因组范围内DNA甲基化的随龄变化特征，发现表观遗传改变是很多物种不同组织和细胞衰老过程中普遍发生的现象。值得关注的是，与年龄相关的DNA甲基化水平变化也发生在生殖细胞中，并可能被传递给下一代^[17-18]。

按照DNA甲基化检测的原理，主要分为基于亚硫酸氢盐转换的方法、基于甲基化敏感性限制性内切酶（methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE）的测序、基于亲和富集预处理的DNA甲基化检测技术和基于单分子测序（single molecule sequencing，SMS）的第三代测序技术等^[19]。

亚硫酸氢盐测序是将化学修饰信息转换为序列差异信息，原始DNA经亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶（C）被转换为尿嘧啶（U），在之后的PCR过程中，尿嘧啶（U）被转换为胸腺嘧啶（T）后用于检测。目前大部分检测技术都以亚硫酸氢盐转换的前处理为基础，其转换效率很大程度上取决于原始DNA输入量。2014年，HOLMES等^[20]采用9种商业试剂盒对从血浆血清、福尔马林固定后石蜡包埋组织（formalin-fixed paraffin-embedding，FFPE）、尿液等中提取的DNA进行亚硫酸氢盐转换的效能进行了比较，包含EpiTect Fast FFPE Bisulfite试剂盒、EpiTect Bisulfite试剂盒、EpiTect Fast DNA Bisulfite试剂盒（德国Qiagen公司），EZ DNA Methylation-Gold试剂盒、EZ DNA Methylation-Direct试剂盒、EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒（美国Zymo Research公司），innuCONVERT Bisulfite All-In-One试剂盒、innuCONVERT Bisulfite Basic试剂盒、innuCONVERT Bisulfite Body Fluids试剂盒（德国analytik jena公司）。从转换效率上看，所有试剂盒均能达到98.7%及以上，其中EpiTect Bisulfite试剂盒最低（98.7%），EZ DNA Methylation-Direct试剂盒最高（99.9%）。实验总耗时从131 min（innuCONVERT系列）到402 min（EpiTect Bisulfite试剂盒），其中对于人工操作时间而言，EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒的最短，只需66 min，而EpiTect Fast FFPE Bisulfite试剂盒和EpiTect Fast DNA Bisulfite试剂盒最长，需要104 min。该研究还发现EZ DNA Methylation- Direct试剂盒从未经预处理的FFPE组织中获得的DNA产率最低，而innuCONVERT Bisulfite All-In-One试剂盒所得DNA产率最高，且后者在所检的不同组织类型来源的样本中均有良好的表现。总体而言，亚硫酸氢盐转换步骤需要50~200 ng初始DNA输入量以达到稳定的转换产率，否则将导致技术误差或者增大后续分析误差。

MSRE法是利用MSRE对CpG位点进行切割的敏感性差异，将DNA消化为不同大小的片段后再进行检测。该方法无需碱基转换可直接对序列的甲基化状态进行分析，其受模板DNA完整性的影响较小，可用于石蜡包埋组织等的DNA甲基化状态的检测，其局限性在于该方法在一定程度上会受酶切步骤的完成程度影响，且只能分析MSRE识别序列中的CpG位点。

基于亲和富集预处理的DNA甲基化检测技术主要有甲基化DNA免疫共沉淀（methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）技术和甲基化CpG结合域测序（methyl-CpG-binding domain sequencing，MBD-Seq）技术，常用于基因组范围内甲基化位点扫描。因为采用的富集蛋白不同，MeDIP倾向于富集CpG的低密度区域，而MBD-Seq倾向于富集CpG高密度区域。

第三代测序技术最具代表性的是单分子实时测序技术和纳米孔测序。该技术具有如下4个特点：（1）无需PCR扩增过程，能够对DNA单链直接测定；（2）通过测定分子量的差异区分不同碱基，无需进行亚硫酸盐修饰的前处理；（3）其读长优势降低了重复序列的比对和拼接难度；（4）建库过程无需全基因组扩增，因此降低了由于建库过程中不同片段扩增效率差异而导致的甲基化位点覆盖率不均衡和碱基错配的概率。三代测序技术可以不进行化学转换过程，有效避免转换效率低和与参考基因组比对困难的问题，但目前还未在法医学领域展开广泛应用，待技术成熟后可成为甲基化检测有效工具。

对于法医学领域而言，目前常用方法绝大部分建立在亚硫酸氢盐转换基础之上。位点特异性DNA甲基化检测主要有焦磷酸测序^[21]、SNaPshot^[22]以及EpiTYPER^[23-24]。此外，还有甲基化敏感性高分辨率熔解法（methylation-sensitive high-resolution melting，MS-HRM）^[25]、基于大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS）^[16]和甲基化检测芯片^[26]的高通量DNA甲基化检测等方法。

焦磷酸测序^[21]基于酶级联化学发光反应，适用于短序列（<60 bp）分析，可对单个CpG位点的甲基化程度进行定性和定量分析，其精确度和可重复性相对较高，检测周期短，仅需2~3 h，尤其适用于存在降解、受污染的DNA样本。

SNaPshot^[22]的原理是将初始DNA样本经亚硫酸氢盐转换后，通过单核苷酸引物延伸来检测CpG位点的甲基化程度，可用于SNP和DNA甲基化检测。此技术具有多通路、高灵敏的特点，但对DNA甲基化测量的准确性不高，仅可做到半定量，检测周期也相对更长（2~3 d）。

EpiTYPER^[23-24]是基因组DNA经亚硫酸氢盐修饰后靶向PCR扩增并反转录，经鸟嘌呤特异性酶切后，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometer，MALDI-TOF-MS）检测原DNA中甲基化的胞嘧啶位点，可实现多重CpG的分析检测，并具有DNA甲基化定量分析能力，但其局限性在于不能区分相同大小的分子，且不适用于设备检测质量窗口（相对分子质量1 000~7 000）以外的分子。

MS-HRM ^[25]仅需实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）仪，且具有简便、快速、成本低的特点，因其在单管内完成PCR和检测过程，能够有效防止污染。该方法可以得到目的基因整体甲基化程度的近似平均值，并不针对特定CpG位点，因此准确性不高，对低水平的DNA甲基化敏感性低，其应用性也较为有限。

随着二代测序技术的高速发展，测序成本大幅度下降，包括人类在内的多个物种甲基化图谱陆续构建完成。将MeDIP技术与二代测序相结合，可以快速有效地定位基因组上的甲基化区域，进而比较不同细胞、组织、样本间的DNA甲基化修饰模式的差异，该技术尤其适用于大样本量研究^[24]。

甲基化检测芯片技术^[26]以美国Illumina公司的Infinium^® Human Methylation 27、Infinium^® Human Methylation 450K、Infinium EPIC试剂盒、850K芯片等为代表。Infinium甲基化检测技术基于单碱基延伸的原理，利用2个特异性探针分别检测甲基化和未甲基化位点。通过计算两者的荧光信号比例，确定检测位点的甲基化水平。该技术具有高覆盖率和高通量的特点，非常适合用于位点的筛选。

受检测技术平台的要求和限制，不同技术在DNA的初始输入量、检测流程的时间和成本、方法的灵敏度、结果的重复性和准确性等方面各有优缺点^[15,27]。从长远应用角度来看，还需开发灵敏度和精确性表现更好的，可以在各法医学实验室广泛使用且能降低时间和人力成本的DNA甲基化检测技术，以满足实际应用的需要。

不同检测平台的技术差异可能造成所测位点甲基化水平的不同^[22,28]，也就是说将某一平台测得的甲基化水平数据直接应用于另一平台数据建立的模型中时，误差会增大^{[15,22,27-29]}。为便于跨平台数据的比较使用，消除各数据集批次效应显得尤为重要^[15-16,29]。FENG等^[29]基于两组不同样本的EpiTYPER检测数据集组1和组2构建了年龄推断模型，随后将组1样本进行焦磷酸测序检测，得到组3数据集，并用基于EpiTYPER数据所构模型对组3数据进行验证分析，结果显示，平均绝对偏差（median absolute difference，MAD）明显增大，这提示在不同平台之间存在平台差异。该研究发现，通过将3组所得数据进行标准分数（standard score）转换后可以明显降低批次效应的影响。HONG等^[28]使用类似的方法在MPS、SNaPshot和450K芯片这3种技术平台数据中引入“平台变量”，达到消除平台差异的显著效果。因此，在使用不同批次甲基化数据时要考虑因技术平台引起的差异，在进行模型训练和验证时，需要加入平台变量，从而有效降低误差，提高模型精度。

从20世纪60年代开始，大量研究^[30-33]发现，个体年龄对全基因组DNA甲基化水平有着深刻的影响，人类基因组中上千万个CpG位点的甲基化状态随年龄的增长而变化。根据这些随个体年龄变化的DNA甲基化位点，一些学者^[30-36]探讨了利用DNA甲基化预测个体年龄的可能性，利用数学算法对一组CpG位点（也称为“时钟CpG”位点）进行计算，用于估计如细胞、组织或器官的年龄（单位为年）。这个估计的年龄，称为表观遗传年龄，或DNA甲基化年龄，不仅反映了个体的生理年龄，也反映了DNA来源细胞、组织或器官的生物年龄。人类DNA甲基化数据已被用于开发表征衰老的生物标记物，称为“表观遗传时钟”（epigenetic clock）。近年来，学者们^[34-36]已利用多个年龄相关甲基化位点（age-related CpG，AR-CpG）的甲基化状态，开发了多个表观遗传时钟。以下介绍其中3个具有代表性的表观遗传时钟。

HANNUM等^[34]于2013年构建的Hannum表观遗传时钟，是利用来自656份全血样本（测试组样本量N₁=482，验证组N₂=174，样本年龄分布为19~101岁）的Infinium^® Human Methylation 450K芯片甲基化图谱构建的。Hannum表观遗传时钟使用弹性网络回归模型对71个CpG位点数据进行评估从而预测DNA甲基化年龄，其DNA甲基化年龄与真实年龄的相关性为96%，均方根偏差（root mean square error，RMSE）为3.9年。在验证队列中，两者相关性为91%，RMSE为4.9年。

尽管该模型是使用全血样本训练而建立的，其对其他类型组织样本也具有一定的实用性。在基于83例胸腺、183例肾、60例肺和42例皮肤组织的甲基化图谱数据进行预测时，尽管每种组织都有明显的线性偏移，但相同组织的不同批次数据的表现是一致的，通过线性关系矫正，得到的推断年龄误差与在血液样本中的相似^[34]。该研究通过计算每例个体的表观甲基组老化率（apparent methylomic aging rate，AMAR），估算出男性的老龄化率高于女性（P<0.05）。这一现象并非血液样本独有，在其他组织中也有发现。此外，该研究也发现，与正常组织相比，基于肿瘤组织计算得到的甲基化年龄更高，几乎全部所选位点或相近基因的功能都与衰老相关，包括阿兹海默症、癌症、组织降解、DNA损伤和氧化应激等。这些发现提示，个体性别以及健康状态会对遗传时钟产生一定的影响。

2013年HORVATH^[35]使用一个更大的集合了Infinium^® Human Methylation27和Infinium^® Human Methylation 450K芯片的DNA甲基化水平数据集用于年龄预测，这一数据集覆盖了来自82例个体的51种组织和细胞类型的7 844份非癌症样本。这一基于多组织数据的年龄预测器，被称作Horvath表观遗传时钟。Horvath表观遗传时钟对年龄的预测基于353个AR-CpG探针，其中193个CpG位点与年龄呈正相关，另外160个CpG位点呈负相关。Horvath表观遗传时钟同样显示出对年龄的精准预测能力，利用所有可以采集的细胞和组织数据进行测算时，Horvath表观遗传时钟预测的年龄与个体真实年龄的相关性高达0.96，MAD较低，为3.6年。

Horvath表观遗传时钟是使用所有可收集到的细胞和组织数据进行训练得到的模型，尽管降低了不同细胞类型异质性的影响，但用于某些单一组织来源样本的预测，如乳腺组织、子宫内膜、真皮成纤维细胞、骨骼肌和心脏等，则会有较高的错误率。后续研究^[37]也发现，通过乳腺组织预测的表观遗传年龄比通过同一供体的血样预测的年龄要高。乳腺组织年龄预测的高误差很有可能与组织的激素效应有关。基于骨骼肌组织开展的研究^[38]也显示，骨骼中与年龄相关的变化与其他组织中的年龄相关CpG位点表现出较小的重叠。

在Horvath表观遗传钟所对应的353个年龄相关CpG位点中，与年龄正相关的位点富集在Polycomb-group靶基因和处于“蓄势待发的”启动子中（这些启动子可能被转化为活性或非活性的状态），而与年龄负相关的CpG富集于CpG岛上下游、弱启动子和强增强子区域。值得注意的是，Horvath表观遗传时钟所对应的CpG位点与年龄相关的基因没有重叠。这些时钟CpG位点的甲基化水平是否与年龄相关的基因表达相关，或是否能够诱导与年龄相关的表达变化还需要进一步研究。此外，含有与年龄相关的CpG位点的基因富集在细胞死亡和存活、细胞生长和增殖、有机体和组织发育以及癌生物功能相关区域。这些时钟CpG位点的甲基化变化非常小，甲基化水平的平均差异的贝塔值（beta value）为0.032。在Horvath和Hannum表观遗传时钟之间共有6个CpG位点重合。与Hannum时钟不同的是，由于使用不同的组织来构建这一表观遗传钟，该时钟不太可能受到不同细胞类型异质性的影响。

2014年WEIDNER等^[36]使用3个CpG位点开发了一个用于生物学年龄推断的模型，这一模型被称为Weidner表观遗传时钟。从基于血液样本的Infinium^® Human Methylation 27和Infinium^® Human Methylation 450K芯片的甲基化图谱筛选位点，共发现了102个与年龄相关的CpG位点，其中3个位点cg25809905、cg02228185、cg17861230分别位于ITGA2B、ASPA和PDE4C基因中，经焦磷酸测序后，使用多元线性模型参与构建年龄预测模型。Weidner表观遗传时钟预测的DNA甲基化年龄与真实年龄之间的MAD为4.5年，RMSE为5.6年。

Weidner表观遗传时钟的优点在于其依托亚硫酸氢盐修饰的焦磷酸测序技术，检测成本低，不需要生物信息学以及特定的微阵列平台，具有一定的独立性和较强的可移植性。因此，在法医学研究中更具有实际应用价值。同样的，正如在Horvath表观遗传时钟中所观察到的，利用Weidner表观遗传钟在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）中计算出的表观遗传年龄约等于0。此外，DNA甲基化年龄在男性和肥胖人群中偏高^[36]。值得注意的是，当利用Infinium^® Human Methylation 450K甲基化芯片数据进行计算时，Weidner表观遗传时钟的预测结果不太精确，这可能是因为其是基于焦磷酸测序数据训练所得。此外，即使在使用芯片数据对Weidner表观遗传时钟进行校准后，在Horvath和Hannum表观遗传时钟中所观察到的死亡率并没有在Weidner表观遗传时钟中被发现。这表明Weidner表观遗传时钟尽管可以通过几个甚至单个CpG标记估计生物学年龄，但对于预测死亡率和疾病风险可能效率不足。

表观遗传时钟还可用于评估个体衰老的速率。通过测量DNA甲基化年龄与真实年龄之间的差异，来计算个体年龄加速度。随着个体年龄的线性增长，生物DNA甲基化年龄也会随时间而变化。如果DNA甲基化年龄高于真实年龄，意味着一个人在生理状态上比他（她）们的真实年龄更大，反之则意味着一个人在生理状态上更年轻。2016年，CHEN等^[39]开发了一种不依赖个体真实年龄的用于评估年龄加速度的方法。针对血液样本，他们基于Horvath表观遗传时钟的353个甲基化位点及Hannum表观遗传时钟的71个甲基化位点，通过区分不含血细胞组分的内在表观遗传年龄加速度（intrinsic epigenetic age acceleration，IEAA）和包含血细胞组分的外在表观遗传年龄加速度（extrinsic epigenetic age acceleration，EEAA），使用cox回归模型与meta分析，分别对这2种方法在不同样本分组中的表现进行研究，发现IEAA与生物学年龄、血细胞组分的改变和传统意义上的死亡风险因素无关，可以更好地反映血细胞中的表观遗传效应。同时发现与使用多组织来源的数据训练的Horvath时钟相比，Hannum表观遗传时钟是仅用全血数据进行训练得到的模型，因此受到血细胞计数的影响更大。EEAA是基于Hannum表观遗传时钟计算的，测量的是衰老过程中血细胞计数变化和内源性DNA甲基化的影响。随着年龄的增长，初始CD8⁺ T细胞数量减少，而衰老的CD8⁺ T细胞增多。该研究^[39]指出，EEAA与衰老CD8⁺ T细胞、成浆细胞的丰度呈正相关，与初始CD8⁺ T细胞丰度呈负相关。从这个角度看，EEAA还测量了免疫衰老的贡献度。对双胞胎的研究^[6-7,12]显示，DNA甲基化年龄加速度是高度遗传的，两者之间的相关性随着年龄递减，这表明非遗传因素的影响随着年龄增长而增加。在成年个体中，通过Horvath表观遗传时钟和Hannum表观遗传时钟推算的DNA甲基化年龄加速度的遗传力均在40%左右^[40]。对回访样本的进一步研究发现，DNA甲基化年龄加速度在整个成年期是相对稳定的，这表明导致年龄估算的准确性下降主要发生在个体成年之前^[41]。一项针对从出生（脐带血）到7岁（外周血）再到15~17岁（外周血）的研究^[42]表明，个体从新生儿期到幼年和青春期的年龄加速度的变化增加，同时表观遗传年龄的相关性随着年龄增长而增强，进一步证实了DNA甲基化年龄在发育早期已被设定。这些结论也与观察到的DNA甲基化修饰在幼龄个体比成年人中的变化更大相一致^[35]。

此外，在表观遗传时钟中发现的年龄特异性甲基化模式与肿瘤细胞中的甲基化图谱显示出显著的相似性，AR-CpG与癌症相关的高甲基化位点之间有很大的重叠^[31,43]。例如，高甲基化AR-CpG主要位于二价启动子位点和Polycomb-group靶基因上^[44]。同样的模式也见于其他多种癌症中，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌等。这暗示着年龄相关DNA甲基化与衰老和癌症均存在联系^[44]。除了癌症之外，体型肥胖个体甲基化差异位点（differentially methylated position，DMP）与年龄相关DMP也有重叠^[45]。这表明年龄相关甲基化模式除了可以预测个体年龄之外，还有可能用来评估健康程度和患病风险。

从这些研究中可以看出，个体的DNA甲基化修饰不仅可以用于预测个体生物学年龄，还可以推算个体衰老速率，用于评估疾病和健康状态。另外，鉴于DNA甲基化修饰在个体发育阶段的不稳定性，将表观遗传时钟应用于法医学实践推算个体生物学年龄时，在成年个体中的应用更有价值。

筛选随龄变化的DNA甲基化位点和合适的统计建模方法来构建DNA甲基化位点年龄推断模型，是进行法医学DNA甲基化年龄推断的前提。值得注意的是，年龄相关的甲基化修饰方式存在于多种人体组织中且具有组织特异性。年龄相关差异甲基化位点（age-related differentially methylated position，aDMP）在不同组织中变化的方向和速率不同^[16]，这提示在筛选随龄变化的DNA甲基化位点用于法医学个体年龄推断时，应充分考虑其组织特异性^[46-47]。

PAN等^[48]选出cg02228185（ASPA）、cg09809672（EDARADD）、cg19283806（CCDC102B）、cg04208403（ZNF423）、chr17：44，390，358（ITGA2B）、cg14361627（KLF14）和cg06639320（FHL2）7个AR-CpG位点，使用多重甲基化SNaPshot技术对中国汉族310份血液样本进行检测，结果发现，在230份血液样本的测试组中，有3个位点与年龄具有强相关性（0.7<r<0.9），其他4个为中等相关（0.5<r<0.7），其中cg19283806与年龄相关性最高（r=0.870 4），而cg04208403最低（r=0.535 5）。此外，在这7个位点中，cg09809672（EDARADD）和cg06639320（FHL2）与年龄为正相关，其他5个位点为负相关。

除了上述研究，也有多项研究^[49-52]借助于MPS和芯片等技术对法医学常见体液进行检测，并在不同体液中鉴定出与年龄高度相关的DNA甲基化位点（表1）。尽管受样本来源和技术误差等因素影响，各位点的相关性有一定差异，但也具有一定的稳定性，如cg08792630同时被PARK等^[49]和LEE等^[50-51]发现在血液中具有高度的年龄相关性；不同体液的研究结果也提示与年龄的相关性具有相似性，如PARK等^[49]报道cg20691722位点在唾液和阴道分泌物中都具有一定程度的年龄相关性。

基于在法医学常见体液或者组织中发现的与年龄高度相关的DNA甲基化位点，一些研究构建了不同的模型^{[27-29,48,53]}。HONG等^[54]检测了54份男性唾液样本的全基因组甲基化图谱，通过对每个甲基化位点进行单因素线性回归分析，筛选出61个年龄相关位点的候选列表，其中与年龄相关性最好的4个位点为cg07547549（SLC12A5）、cg14361627（KLF14）、cg08928145（TSSK6）、cg19671120（CNGA3）。以此4个位点建模对该54份样本进行年龄推测，得到R²=0.969，RMSE=3.833。除了上述4个位点之外，该研究还挑选了2个在候选列表中多次出现的基因SST和TBR1上的位点（位于SST上的cg00481951、位于TBR1上的cg12757011），以及位于基因PTPN7上的细胞特异性位点cg18384097，共计7个位点利用SNaPshot技术对18~65岁的226份个体唾液样本进行检测，结果显示，在这一系统中cg14361627和cg07547549与年龄的相关系数最高。SCHWENDER等^[53]对21~69岁的141份口腔拭子样本的研究发现，从PDE4C、ELOVL2、ITGA2B、ASPA、EDARADD、SST、KLF14和SLC12A5共8个基因的88个AR-CpG中，基于主成分分析和相关性分析，筛选出在口腔拭子样本中相关性最强的cg17861230+36 bp（PDE4C）、cg09809672-12 bp（EDARADD）和cg14361627（KLF14）共3个位点用于年龄推断模型的构建。其中，cg14361627（KLF14）在HONG等^[54]的研究中也有被使用，但另外2个位点为首次报道。该研究同时也指出，虽然在其他针对血液样本的研究中ELOVL2被认为是最有潜能的标志之一，但基于该基因包含的位点在口腔拭子中的表现相关性较差，所以SCHWENDER等^[53]建立的模型中最终并未加入ELOVL2的相关位点。HONG等^[54]的模型中也并未包含ELOVL2，而另一针对烟头样本的研究模型^[25]中使用了该基因。

尽管上述大部分DNA甲基化位点在不同体液中对于年龄预测的能力表现不一，但也有研究^[22]表明，一些CpG位点在血液、唾液、精液等类型样本中同时显示随龄变化的高度相关性，表现出了较好的跨组织年龄推断的能力。JUNG等^[22]基于SNaPshot技术，检测了448份样本（包含150份血液、150份唾液、148份口腔拭子）的5个甲基化位点chr6：11044628（ELOVL2）、chr2：105399282（FHL2）、chr7：130734355（KLF14）、chr1：207823681（C1orf132/MIR29B2C）和chr3：160450189（TRIM59），其中chr6：11044628（ELOVL2）、chr7：130734355（KLF14）和chr3：160450189（TRIM59）在所检的3种体液中都显示出与年龄的高度相关性，而另外两个位点chr2：105399282（FHL2）和chr1：207823681（C1orf132/MIR29B2C）在口腔拭子中表现为低甲基化或非甲基化模式，与年龄的相关性欠佳。研究使用以上5个位点构建了针对单一样本以及同时使用3种不同组织样本的综合模型，分别计算所得到的DNA甲基化年龄与真实年龄的误差。针对单一样本构建模型所得MAD分别为3.478（血液）、3.552（唾液）、4.293（口腔拭子），针对以上3种组织的综合模型所得的MAD为3.844。如果检材包含多种样本类型，使用跨组织特异性表现较好的位点也可以在一定程度上减小误差^[49,55-56]。随着更多跨组织特异性位点的发现，越有利于开发出更多组织类型通用的年龄推断模型。

近年来基于多种技术所构建的部分年龄推断模型及其相关信息见表2。不同研究也对年龄推断模型采用了不同的评价指标进行评估，总体来说模型预测与实际年龄之间的偏差参差不齐，且由于所采用的评价指标不同，无法直接对各模型年龄推测的准确性进行比较。

在目前的研究中，常见的计算模型分为线性回归模型和非线性回归模型。XU等^[59]从8对女性同卵双胞胎血样的Infinium^® Human Methylation 450K数据中筛出11个甲基化位点，结合Sequenom MassARRAY平台检测的49例女性无关个体中这11个甲基化位点的DNA甲基化修饰水平，比较了4种计算模型用于评估年龄推断的准确性，包括多元线性回归、多元非线性回归、反向传播神经网络和支持向量回归（support vector regression，SVR）模型，研究结果显示，SVR准确性最高，MAD为2.8年。SMEERS等^[60]基于同一数据集比较了加权最小二乘回归（weighted least squares，WLS）、普通最小二乘回归（ordinary least squares，OLS）、分位数回归（quantile regression）模型的表现，结果表明，在该数据集中WLS的准确性更高，同时指出分位数回归模型可能更适合处理非常数、非正态分布的数据。FENG等^[29]基于EpiTYPER平台测得390例15~75岁中国北方汉族男性样本在9个AR-CpG的数据，通过加入系统特征选择，对比了3种不同计算模型，结果显示，SVR、人工神经网络（artificial neural network，ANN）2种模型的性能并不明显优于线性模型。

因此，针对不同的数据类型，其年龄推断模型的选择也有所不同。如果样本是非常数、非正态分布，则需要更复杂的多元分析或机器学习方法去完善模型的构建，以达到更小的误差。

目前采用现有技术利用DNA甲基化位点进行年龄推断存在一定的局限性。首先，在构建年龄推断模型时，位点、检材、检测方法、构建模型等多种因素都会影响年龄推断模型的准确性。以检材这一因素为例，多项研究^[61-63]表明，血液中甲基化水平与多种疾病的发生密切相关，因此在选择年龄推断位点时应避开疾病的影响。除了个体健康状态，采自于不同人群或者不同组织的样本其DNA甲基化年龄推断模型也可能有偏差。因此，不同因素对DNA甲基化影响的研究还需进一步深入。其次，现有技术所需DNA输入量比其他遗传标记检测所需起始量要大很多，故很有可能并不适用于从案件现场所采集的微量血斑、唾液斑等微量检材的检测。此外，由于大部分技术需要使用亚硫酸氢盐修饰初始DNA，这一前处理会破坏DNA的完整性，将损失一定的信息量，影响后续检测。为了提高DNA甲基化年龄推断的准确性，有学者提出了可以联合不同的年龄推断方法以达到更高的精确度，如同时考虑骨龄、齿龄、信号结合T细胞受体删除环（signal joint T cell receptor excision circles，sjTREC）以及RNA分子^[64]，然而其效果甚微。考虑到应用前景，检测平台应兼顾操作简便、检测时间短、成本低廉、高准确性、灵敏度、重复性等优点，现有平台很难同时满足这些要求，开发或提升DNA甲基化检测技术尤为重要。