急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是人群死亡的重要原因之一^[1]，其发病率呈现逐年升高的趋势^[2]。动脉粥样硬化是AMI最常见的病因，几乎占年轻人AMI的90%^[3]。其余10%继发于非斑块性病因，包括自发性冠状动脉夹层、冠状动脉血管痉挛、高凝状态、冠状动脉栓塞现象、自身免疫介导的炎症和药物诱导的闭塞^[4]。虽然发病机制有所不同，但两种情况均会导致AMI，进而发生死亡。在法医学鉴定中，AMI者死亡过程迅速，心肌缺血时间较短，死后常缺乏客观的法医学诊断指标，其精准鉴定是法医病理学的一大难题。因此，寻找准确、可靠的生物标志物已成为法医学亟待解决的问题之一。

代谢物为生物系统生化活动调控的末端环节，对生物体内代谢产物的变化进行分析能够更直接、更准确地反映机体的病理生理状态^[5]。近年来，代谢组学在法医学鉴定研究中广泛应用。CAO等^[6]通过代谢组学和机器学习结合的方法，在AMI尸体的心血和心肌中分别鉴定出18种和16种差异代谢物。ZHANG等^[7]采用气相色谱-高分辨率质谱非靶向代谢组学技术验证了AMI大鼠血浆的7种差异代谢物。以上研究证明了代谢组学技术应用于法医学AMI鉴定的可行性。

本研究拟建立AMI大鼠模型，运用超高效液相色谱-质谱法（ultra-high performance liquid chromatogra-phy-mass spectrometry，UPLC-MS）分析其尿液中代谢物的变化，筛选与AMI相关的差异代谢物，并探讨可能的分子机制，以期为AMI的法医学鉴定及其猝死机制研究提供新思路。

AU5800全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter公司），HX-300S动物呼吸机（成都泰盟软件有限公司），BL-420S生物信号采集与分析系统（成都泰盟软件有限公司），2-16P台式低温离心机（美国Sigma公司），Lab-1A-80真空冷冻干燥机（北京博医康仪器有限公司），UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100.0 mm，1.8 μm；美国Waters公司），Milli-DI^®水纯化系统（德国Merck公司）。

维生素D3（美国Sigma公司），异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），多聚甲醛、乙醇、二甲苯（天津市科密欧化学试剂有限公司），甲醇、甲酸、乙腈（美国Sigma公司）。

SPF级雄性SD大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司） 18只，体质量（200±20） g，6~8周龄，饲养于室内温度24~26 ℃、湿度40%~60%、12 h昼夜交替的房间。适应性喂养1周后，将18只大鼠随机分为3组，假手术组、AMI组、高脂血症+急性心肌梗死组（hyperlipidemia + acute myocardial infarction，HAMI）组，每组6只。本研究已获得山西医科大学科学研究伦理审查委员会的审批（审批文号2021LL244）。

假手术组：经普通标准饲料喂养12周后，使用AU5800全自动生化分析仪检测大鼠血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）。术前禁食禁水12 h，使用动物专用异氟烷（2%~3%）麻醉大鼠，使用夹子夹住大鼠尿道口处，将其固定在手术台上，经口气管插管并连接HX-300S动物呼吸机，通气频率70次/min，潮气量0.8~1 mL，呼吸比2∶1。四肢连接生物信号采集与分析系统记录术中心电图。于第3~4肋间切开心脏搏动最强处皮肤，钝性分离肌层组织，剥离心包暴露心脏，用6-0缝线在左心耳根部下方3~5 mm处穿过，但不结扎。探查无出血后关闭胸腔，挤出胸腔内空气，防止大鼠因气胸死亡，迅速将胸小肌和胸大肌复位，关胸。使用4-0缝线对皮肤切口处进行荷包缝合。将大鼠置于37 ℃恒温电热毯上，密切观察其状态。术后30 min脱颈椎处死大鼠。

AMI组：同假手术组方法，术中用6-0缝线在左心耳根部下方3~5 mm处连同少量心肌组织结扎冠状动脉左前降支诱发死亡。

HAMI组：通过高脂乳剂灌胃联合腹腔注射维生素D3建立高脂血症模型^[8]。高脂乳剂的配置同前期研究^[9]。腹腔注射维生素D3（600 000 IU/kg）后，次日开始进行连续12周的高脂乳剂灌胃（1 mL/100 g，2次/d）。其间于第3、6、9周分别再次腹腔注射维生素D3（100 000 IU/kg）。喂养12周后，检测大鼠血清中TC、TG、HDL和LDL的含量，并计算动脉粥样硬化指数（atherosclerosis index，AI）判断建模是否成功，AI=（TC-HDL）/HDL。AI大于3.8提示发生冠状动脉粥样硬化^[8]。随后采用AMI组的方法结扎冠状动脉左前降支诱发死亡。

大鼠死亡后，立即使用注射器于膀胱采集大鼠尿液，置于无菌微量离心管中，-80 ℃保存，用于代谢组学检测。再取大鼠完整心脏置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色。

将固定好的心肌组织进行梯度75%、85%、90%、95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋，切片（厚度5 μm），粘片与烘片，并进行HE染色，镜下观察拍照。

提前将尿液样本梯度解冻，取200 μL尿液样本，加入200 μL甲醇，使用2-16P台式低温离心机以12 927×g离心15 min，收集上清液。将上清液置于Lab-1A-80真空冷冻干燥机中干燥后，用200 μL甲醇复溶，以12 927×g离心15 min，取上清液进行分析。所有待测尿液样本各取10 μL，混合制成质量控制（quality control，QC）样本。

使用UltiMate 3000高效液相色谱仪进行代谢组学检测。为减少在整个分析过程中可能产生的仪器系统误差，所有被检测的尿液样本随机排序进样。为观察是否存在样品组分残留、考察系统稳定性，先将QC样本连续进样5次后再进待测尿液样本。每进10个待测尿液样本后，将空白样本（纯乙腈溶液）和QC样本各进样1次。

色谱条件：采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，柱温40 ℃，流速0.2 mL/min，进样量5 μL。流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；流动相梯度洗脱程序：0~2 min，2%B；2~3 min，2%B~35%B；3~17 min，35%B~70%B；17~18 min，70%B；18~29 min，70%B~98%B；29~31 min，98%B；31~33 min，98%B~2%B；33~35 min，2%B。

质谱条件：采用电喷雾离子源，喷雾电压正极为3.5 kV，负极为2.5 kV，质量扫描范围m/z 80~1 200。毛细管温度为320 ℃；加热器温度为300 ℃；鞘气流速35 arb，辅助气流速10 arb；分辨率设定为“MS Full Scan 35 000 FWHM”和“MS/MS 17 500 FWHM”，碰撞能量归一化设定为12.5、25和37.5 eV。

大鼠血脂数据用x¯±s表示，使用SPSS 26.0软件（美国IBM公司）对数据进行统计分析。采用独立样本t检验比较组间差异，检验水准α=0.05。采用Compound Discoverer 3.1软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）对UPLC-MS原始数据进行保留时间校正、色谱峰对齐及峰面积提取等预处理。对数据进行峰面积归一化处理后，采用SIMCA 14.1软件（瑞典Umetrics公司）进行多元化分析：使用主成分分析（principal component analysis，PCA）对QC样本进行分析，以确保检测过程中拥有良好的仪器稳定性和较高的数据质量可信度；使用偏最小二乘法判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）可视化不同组别之间的分离度，通过置换检验的响应值以及模型适应度R²和预测能力Q²的计算进行模型验证；使用正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）分析不同组别之间的代谢差异，为了避免模型发生过拟合的情况，采用置换检验对OPLS-DA模型进行有效性评估。进一步采用S-plots图对所有变量进行初步筛选。使用SPSS 26.0软件对不同组别之间的代谢物进行独立样本t检验，以变量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）>1和P<0.05作为差异代谢物筛选标准。在人类代谢组学数据库中进行代谢物鉴定。利用MetaboAnalyst 6.0（https://www.metaboanalyst.ca/docs/Tutorials.xhtml）分析差异代谢物所涉及的相关代谢通路。采用韦恩图比较不同组别之间的差异代谢物，并对AMI和HAMI组共同的差异代谢物进行单变量受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线分析。

经高脂饮食喂养12周后的HAMI组大鼠体质量明显比AMI组和假手术组增加，毛色晦暗，倦卧懒动，主动进食量减少（表1）。经普通标准饲料喂养12周后，AMI组和假手术组大鼠毛色光滑柔顺，活泼好动，进食良好。HAMI组和AMI组大鼠结扎冠状动脉左前降支后观察到结扎部位以下心肌组织苍白，搏动明显减弱，结扎后均在20~30 min内发生死亡。

与假手术组和AMI组相比，HAMI组的TC、LDL浓度均升高（表1）。假手术组和AMI组AI值较低，而HAMI组的AI值大于3.8（5.29±1.18，P<0.05），提示HAMI组大鼠发生冠状动脉粥样硬化。

假手术组心电图节律平稳正常。AMI和HAMI组于冠状动脉左前降支结扎后5 min左右，均显示ST段抬高（图1），提示AMI和HAMI组发生急性心肌梗死。

HE染色结果（图2）显示，假手术组冠状动脉和心肌组织未见异常。AMI组冠状动脉未见异常，心肌组织出现收缩带坏死。HAMI组大鼠冠状动脉内膜增厚，内皮细胞排列紊乱，内膜下有粥样物质沉积，血管周围有炎症细胞浸润，心肌收缩带坏死，肌质凝聚。

所有QC样本都紧密聚集在一起，在PCA中没有表现出明显的离散趋势，表明实验仪器及实验数据稳定性好，可进行后续分析（图3）。

使用PLS-DA对各组大鼠的尿液样本进行分析，PLS-DA得分图显示各组样本分离趋势良好，说明其内源性代谢物发生了变化（图4）。根据OPLS-DA得分图可以看出，假手术、AMI和HAMI组均明显分离（图5）。

为了避免模型发生过拟合的情况，采用置换检验对OPLS-DA模型进行有效性评估。随着置换保留度的增加，模型适应度和预测能力随之增加，表明模型的拟合度良好，实验结果可靠（图6）。进一步采用S-plots图对所有变量进行初步筛选，不同组别之间的S-plots图见图7。

与假手术组相比，AMI组中共有40种内源性代谢物发生了变化，其中12种相对含量上调，28种相对含量下调。与假手术组相比，HAMI组中共有61种内源性代谢物发生了变化，其中20种相对含量上调，41种相对含量下调。这些代谢物主要是氨基酸、维生素和核苷等。表2展示了AMI和HAMI组VIP值排名前五的差异代谢物。对比AMI和HAMI组的差异代谢物，发现有22种代谢物相同，AMI组有18种不同的代谢物，HAMI组有39种不同的代谢物（图8）。

通过MetaboAnalyst 6.0对AMI和HAMI组共同的22种差异代谢物进行代谢通路富集分析，主要涉及的代谢通路为烟酸和烟酰胺代谢（图9）。

对AMI和HAMI组共同的22个差异代谢物进行单变量ROC曲线分析（图10）。22个代谢物的曲线下面积（area under the curve，AUC）值均大于0.5，其中19个的AUC值大于0.7，在95%可信区间内N8-乙酰亚精胺、3-甲基组胺和胸腺嘧啶的AUC值大于0.95（表3）。

AMI最常见的病因是动脉粥样硬化^[3]，少数继发于非斑块性病因。虽然发病机制有所不同，但两种情况均会导致AMI，进而死亡。为了模拟法医学实践中人体AMI的病理生理状态，本研究基于课题组前期动物模型制备方法^[9]，构建了两种AMI大鼠模型，并以假手术组大鼠模型作为对照，排除手术过程中开胸暴露对代谢物的影响。AMI组大鼠模拟急性心肌梗死，正常饮食喂养12周后结扎冠状动脉。AMI组结扎冠状动脉左前降支后观察到冠状动脉供血区域的心肌苍白，实时心电图显示ST段抬高，提示心肌梗死的发生。HE染色结果提示，AMI组冠状动脉未见异常，心肌组织出现收缩带坏死，进一步验证了心肌梗死的发生。以上结果表明，本次AMI组模型制备成功。HAMI组模拟在高脂血症的基础上发生急性心肌梗死。HAMI组大鼠高脂饮食喂养12周后结扎冠状动脉。与假手术组相比，HAMI组大鼠的TC、LDL浓度升高，AI值升高，提示高脂血症的发生。HAMI组结扎冠状动脉左前降支后观察到冠状动脉供血区域的心肌苍白，实时心电图显示ST段抬高，提示心肌梗死的发生。HE染色结果提示，HAMI组大鼠冠状动脉内膜增厚，内皮细胞排列紊乱，管腔狭窄，心肌组织出现收缩带坏死，进一步证实了高脂血症和心肌梗死的形成。以上结果表明，本研究HAMI模型制备成功，但高脂血症模型冠状动脉粥样硬化的改变不够典型，还需进一步的改进。

相较于传统的血液检测，尿液检测采集过程简单且无创，样本量大，可满足各种检测的要求；尿液组分相对单一，检测难度较低；最重要的是，尿液中没有稳态调控机制，可以更早、更灵敏地反映人体异常变化，对于生物标志物的研究来说是非常有利的。因此，本研究采用UPLC-MS技术对AMI大鼠模型尿液中的小分子代谢物进行检测。

从尿液代谢组学结果中筛选出40种与AMI相关的差异代谢物，61种与HAMI相关的差异代谢物，其中18种为AMI特有的代谢物，39种为HAMI特有的代谢物。分析认为AMI和HAMI代谢物不同的原因可能与两组的饮食差异有关。AMI特有的18个差异代谢物中VIP值排名前三的3-吲哚丙烯酸、L-抗坏血酸2-硫酸盐和4-胍基丁酸与HAMI特有的39个差异代谢物中VIP值排名前三的马尿酸、肌酐和肌酸有望成为鉴别AMI和HAMI两种死亡方式的生物标志物。本研究与以往AMI的代谢组学研究^[10-11]结果一致，均观察到机体能量代谢的改变。这6种代谢物已被既往研究^[10-11]证实与AMI密切相关。

AMI和HAMI组模拟了法医学实践中发生AMI的两种情况。本研究利用两组共同的差异代谢物进行分析，能够更加精准地筛选出AMI潜在的特异生物标志物。因此，对AMI和HAMI组共同的22个差异代谢物进行单变量ROC曲线分析，发现N8-乙酰亚精胺、3-甲基组胺和胸腺嘧啶的AUC值大于0.95，有望成为诊断AMI的潜在生物标志物。

多胺，包括亚精胺及其衍生物，是一种脂肪分子，可通过调节心肌细胞凋亡和自噬来调节心肌缺血应激反应^[12]。临床研究也已经确定了多胺在缺血级联反应期间心肌细胞死亡中的关键调节作用^[13]。此外，多胺消耗已被证明可以保护心肌细胞免受缺血诱导的凋亡^[14]。细胞内亚精胺由亚精胺N8-乙酰转移酶分解为N8-乙酰亚精胺，然后从细胞中排泄出来，因此N8-乙酰亚精胺是细胞内多胺活性的血浆指示器^[15]。NAYAK等^[16]提出N8-乙酰亚精胺参与心肌细胞死亡的调节，并在缺血性损伤中导致心脏功能不全，是一种潜在的缺血性心肌病的生物标志物。本研究发现，在AMI和HAMI组中N8-乙酰亚精胺均有所降低，与上述研究结果一致，证明了N8-乙酰亚精胺在AMI中发挥着关键性的作用，可能与其调节心肌细胞凋亡和自噬有关。3-甲基组胺是组胺的一种代谢物。LIU等^[17]通过分析心肌梗死大鼠模型组织的代谢差异物，发现22种代谢物（包含3-甲基组胺）可作为心肌梗死的潜在生物标志物。COSTINITI等^[18]发现N1-甲基组胺是一种重要的心脏底物，能为线粒体酶单胺氧化酶提供燃料并引发活性氧产生，参与心脏损伤，这表明甲基组胺在AMI中起到重要的作用。本研究结果与上述研究一致，表明3-甲基组胺有望成为诊断AMI的潜在生物标志物。但其与AMI的具体关系和机制尚未阐明，需要进一步研究。胸腺嘧啶是一种嘧啶碱基，2-氨基异丁酸是嘧啶代谢的最终产物。已有研究^[19]发现7种代谢物（包含胸腺嘧啶、2-氨基异丁酸）与心血管疾病显著相关。JIANG等^[20]使用反相液相色谱-四极杆飞行时间质谱在AMI大鼠模型血清中鉴定出14个潜在的生物标志物，包含5-甲基胞嘧啶和胸苷，均可代谢为胸腺嘧啶。ZHAO等^[21]使用基于液相色谱-四极杆飞行时间质谱的代谢组学方法检测出冠心病患者的差异代谢产物主要涉及的代谢通路有嘧啶代谢。本研究发现胸腺嘧啶在AMI组中有所降低，结合上述研究证明，胸腺嘧啶的改变可提示AMI的发生。尽管AMI患者的尿液、血液^[20-21]与组织^[4，17]的代谢组学分析结果存在差异，这可能归因于样本来源、采集方法、处理过程及分析方法的差异，但在血液和组织代谢组学分析中，均检出上述3种代谢物，与本研究结果一致。综上所述，N8-乙酰亚精胺、3-甲基组胺和胸腺嘧啶有望成为诊断AMI的潜在生物标志物。

通过进一步对22种尿液差异代谢物的通路富集进行分析，发现AMI主要与烟酸和烟酰胺代谢异常有关。烟酸有两种代谢路径：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的形成和烟酸甘氨酸偶联物的形成。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的分解代谢释放烟酰胺，随后被甲基化和（或）氧化形成许多代谢物，其中2-吡啶酮占主导地位^[22]。烟酸及其代谢物用于治疗和预防心血管疾病已有多年的历史^[23]。有研究^[24]表明，烟酸受体激动剂会导致心脏收缩力的急性降低。此外，烟酸及其部分代谢物的心脏保护作用也被证实与其可以限制缺血再灌注损伤以及抑制脂肪分解和极低密度脂蛋白的产生有关^[25]。这些证据表明，烟酸和烟酰胺代谢在AMI中扮演了重要的角色。

综上所述，本研究应用非靶向代谢物组学分析获得了与AMI有关的22种差异代谢物及其代谢通路（烟酸和烟酰胺代谢），并通过ROC曲线筛选出诊断价值最高的3种代谢物——N8-乙酰亚精胺、3-甲基组胺和胸腺嘧啶。本研究结果表明，非靶向代谢组学方法有望用于AMI研究，N8-乙酰亚精胺、3-甲基组胺和胸腺嘧啶是AMI的潜在诊断指标。今后，我们将密切关注血液样本与心肌组织中的代谢变化，以及其与尿液代谢物的差异；同时扩大样本量，并采用人群样本进行验证，以进一步提高该方法在法医学实践中的应用潜力。