相较于硝酸、盐酸以及硫酸等强酸试剂[4-6]，国内外学者尝试使用更为温和的试剂用于生物组织中的硅藻提取，主要有酶消解法[7]、Soluene-350法[8]和过氧化氢加热法[9]等。常规酶消解法多采用胃蛋白酶、胰蛋白酶[10-11]，但这些生物酶价格昂贵、消解能力有限，尚难以在法医学实践中予以推广；相较于淡水硅藻，Soluene-350法对海水硅藻的破坏较大[8]，因此在海水溺死鉴定中存在短板；有文献[9]证实过氧化氢加热法可用于硅藻检验，但在实际操作中，生物血液中的过氧化氢酶可与过氧化氢发生剧烈反应并产生大量气泡，不利于生物样本的稳定消解且需要大量时间沉降气泡，其在法医学实践中的应用价值仍需进一步验证。
鉴于此，本研究提出一种新型组织消解方法，即蛋白酶-过氧化氢（protease-hydrogen peroxide，PHP）消解法，并将该方法与传统的硝酸破机法在肺组织硅藻提取效能方面进行比较，期望PHP消解法能够在未来应用于法医学实践。
1 材料与方法
1.1 水样及组织收集
现场水样及肺组织均来自2022—2023年司法鉴定科学研究院实际案件。现场水样由疑似溺死案件委托方提供，共收集10例现场淡水水样（约150 mL/例）并将其充分混合，置于一2 L水桶内，于暗室常温保存以备后续实验研究。肺组织在非溺死案件的尸体解剖中获取，共10例，均为左肺下叶靠近边缘含肺膜的组织样本，进行肺组织样本提取时严格按照《人体组织器官中硅藻硝酸破机法检验》（GA/T 813—2008）行业标准，以防止外源性硅藻污染，将组织样本放置于-20 ℃冰箱中储存以备后续实验研究。
本研究已通过司法鉴定科学研究院伦理委员会的审批，涉及的组织样本均已获得家属同意并签字。
1.2 水样处理
将收集的水样充分混匀后，用移液枪从中吸取1 mL转移到10 mL离心管中，然后将离心管以1 000×g离心10 min，弃去部分上清液，留存约100 μL液体，使用移液器充分吹打、混匀后涂片，在400倍光镜下检验。重复上述实验10次，计算所有涂片中的硅藻数量。
1.3 组织处理及分组
将收集的肺组织平均分成40份（2 g/份），分为A、B、C、D组，每组10份。使用注射器在A、B两组肺组织中注射含有硅藻的水样（2 mL/份），分别用PHP消解法和硝酸破机法处理；C、D两组肺组织则被注射蒸馏水（2 mL/份），分别用PHP消解法和硝酸破机法处理。观察样本是否被外源性硅藻所污染。为确保实验过程中所使用的实验器材免受污染，每次操作前均使用蒸馏水对实验器材进行2~3次的冲洗。
1.4 PHP消解法
称取1 g肺组织，将其充分切碎后移入50 mL离心管中，加入30 mL木瓜蛋白酶溶液（10 mg/mL），70 ℃恒温振荡1 h后，加入20%十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）溶液3 mL，再次70 ℃恒温振荡1 h。随后，以1 000×g离心10 min，弃去上清液并使用蒸馏水冲洗1~2次后，加入30%过氧化氢（分析纯） 3~5 mL，80 ℃恒温振荡1 h。最后，将上述液体以1 000×g离心10 min，弃去上清液，留存约100 μL液体，混匀后涂片、封片，于400倍光镜下检验并对硅藻计数。
1.5 硝酸破机法
称取1 g肺组织，将其充分切碎后移入250 mL烧杯中。将烧杯放置于磁力搅拌器上，向其中加入1~2滴无水乙醇（分析纯），经无水乙醇脱水后加入8 mL发烟硝酸（分析纯）。放入磁力珠后使其充分加热搅拌直至液体变澄清，将最终得到的液体移入10 mL离心管中，以1 000×g离心10 min，弃去上清液并使用10 mL蒸馏水冲洗1~2次，直至液体不再呈现黄色，最后一次离心后留存约100 μL液体，混匀后涂片、封片，于400倍光镜下检验并对硅藻计数。
1.6 数据分析
使用SPSS 26.0软件（美国IBM公司）中的独立样本t检验对水样与肺组织样本中的硅藻数量进行统计分析，检验水准α=0.05。
根据水样和肺组织样本中的硅藻数量（包括硅藻碎片数量）计算硅藻回收率、硅藻碎片占比，其中：硅藻回收率=涂片中实际硅藻数量÷水样中硅藻平均数量×100%；硅藻碎片占比=涂片中硅藻碎片数量÷涂片中实际硅藻数量×100%。
由于人工计数存在一定的误差，因此本实验将3位精通硅藻识别的专家在光镜下观察并统计的涂片中实际硅藻数量、水样中硅藻数量以及硅藻碎片数量取平均值，以减少人工误差。
2 结 果
2.1 PHP消解法对肺组织的反应过程
图1
图1
PHP消解法消解肺组织的过程
A：消解前；B：经酶消解后；C：加入20% SDS后；D：加入过氧化氢后。箭头示肺组织。
Fig. 1
The process of lung tissues digested by the PHP digestion method
2.2 镜下硅藻观察
图2
图2
硝酸破机法处理后光镜下的硅藻
A：菱形藻属Ⅱ；B：曲壳藻属；C：双壁藻属；D：异极藻属；E：短缝藻属；F：菱形藻属Ⅰ；G：桥弯藻属；H：舟形藻属。
Fig. 2
Diatoms under light microscope following nitric acid digestion
图3
图3
PHP消解法处理后光镜下的硅藻
A：菱形藻属Ⅱ；B：曲壳藻属；C：双壁藻属；D：异极藻属；E：短缝藻属；F：菱形藻属Ⅰ；G：桥弯藻属；H：舟形藻属。
Fig. 3
Diatoms under light microscope following PHP digestion
2.3 PHP消解法及硝酸破机法的硅藻回收结果
C、D组肺组织中均未检出硅藻及碎片（表1），表明本研究在组织消解前、收集样本时以及组织消解过程中均未发生外源性硅藻污染的情况，因此，后续实验能够真实反映PHP消解法与传统硝酸破机法的硅藻提取效能。
表1
PHP消解法及硝酸破机法的硅藻提取效能比较 (n=10，
Tab. 1
| 样本 | 硅藻数量/个 | 硅藻回收率/% | 硅藻碎片占比/% |
|---|---|---|---|
| 水样 | 380.00±21.08 | 100.00 | 0 |
| A组 | 357.00±12.39 | 93.95±2.301） | 0.53±0.051） |
| B组 | 216.00±8.861） | 56.84±4.881） | 2.10±0.501） |
| C组 | 0 | 0 | 0 |
| D组 | 0 | 0 | 0 |
相较水样而言，硝酸破机法（B组）的硅藻提取数量不多，硅藻回收率仅为56.84%（P<0.05）且硅藻碎片占比（2.10%）高于水样（P<0.05）；而经PHP消解（A组）后的肺组织中硅藻数量与水样比较差异无统计学意义（P>0.05），硅藻回收率高达93.95%，优于硝酸破机法（56.84%）。
2.4 PHP消解法及硝酸破机法对不同科属硅藻的回收结果
采用PHP消解法及硝酸破机法对含有硅藻成分的肺组织进行处理，观察两种方法对不同科属硅藻的回收情况（表2）。经形态学辨认，数量最多的5种硅藻科属分别为曲壳藻属、菱形藻属Ⅰ、菱形藻属Ⅱ、双壁藻属和桥弯藻属。PHP消解法处理后，除菱形藻属Ⅱ、桥弯藻属外，其余科属硅藻回收率均高于90%，但仅菱形藻属Ⅱ数量与水样中菱形藻属Ⅱ数量的差异具有统计学意义（P<0.05）。相较而言，硝酸破机法处理后多数科属硅藻数量及回收率降低，最低达34.78%；曲壳藻属、双壁藻属、桥弯藻属硅藻数量相较于水样中相同科属硅藻数量差异具有统计学意义（P<0.05）。
表2
PHP消解法及硝酸破机法处理后不同科属硅藻的回收效能比较 (n=10，
Tab. 2
| 硅藻科属 | 水样/个 | A组 | B组 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 数量/个 | 回收率/% | 数量/个 | 回收率/% | |||
| 曲壳藻属 | 154.00±10.10 | 141.00±2.10 | 91.83±5.41 | 65.00±13.501） | 42.13±5.51 | |
| 菱形藻属Ⅰ | 44.00±2.49 | 40.00±2.16 | 91.80±0.81 | 36.00±8.50 | 81.29±12.74 | |
| 菱形藻属Ⅱ | 45.00±3.74 | 36.00±0.941） | 80.07±4.92 | 22.00±12.00 | 48.89±12.77 | |
| 双壁藻属 | 33.00±3.68 | 30.00±3.30 | 90.82±2.16 | 20.00±3.501） | 59.69±2.98 | |
| 桥弯藻属 | 23.00±3.56 | 19.00±1.25 | 81.17±8.01 | 8.00±3.001） | 34.78±7.74 | |
3 讨 论
硅藻是一种在湿润环境中广泛分布的含色素体的单细胞藻类[12-13]，这些微生物的大小通常在几微米至几百微米，由于其对周围环境变化具有较高的敏感性，故常被用于水质监测和评估[14-15]。硅藻特有的硅质外壳使得其对强酸物质具有较高的耐受性[16]。根据这一特性，法医工作者常常使用强酸去除人体及水样中的有机质成分从而便于观察具有特定花纹结构的硅藻外壳。除硝酸外，有学者[17]使用了腐蚀效果更为突出的酸性溶液（即勒福特王水）进行硅藻的提取，相较于传统的硝酸破机法（硅藻回收率为66.3%），该方法的硅藻回收率略有提高，达71.1%；然而使用该方法对死后入水动物进行硅藻检验时，出现了3例假阳性结果[18]。针对强酸消化法的缺点，本研究提出了一种新型生物组织消解方法，即PHP消解法，该方法反应过程温和，所使用的试剂安全、环保且价格低廉，更为重要的是其硅藻提取效能远高于传统的强酸消化法，硅藻回收率高达93.95%，具有较高的实用价值。
PHP消解法充分借鉴了酶消解法及过氧化氢加热法的实验步骤并进行了适当调整，能够最大程度地发挥两种方法的突出优势，从而高效提取生物样本中的硅藻成分。早在1993年就有学者尝试使用蛋白酶K进行肺组织消解[7]，但该方法在消解过程中会产生大量杂质，不利于硅藻形态结构的镜下观察。相较而言，过氧化氢加热法能够有效减少杂质的生成，且对实验环境的要求较低[9]。过氧化氢作为一种强氧化剂，能够快速消解生物组织，但其与新鲜样本中的过氧化氢酶反应剧烈，易产生大量气泡，需要长时间甚至过夜静置，以便气泡消散，不利于硅藻的快速提取。针对这一问题，本研究根据蛋白酶反应温和的特性对生物组织进行预处理，有效分解了与过氧化氢剧烈反应的生物化学成分，两者的有机结合克服了蛋白酶反应不充分和过氧化氢反应耗时较长的局限。并且，相较于蛋白酶K消解法和过氧化氢加热法，PHP消解法能够在2~3 h内完成硅藻提取，提高了生物样本中硅藻的提取效率。
除明确水中尸体的死亡原因外，法医工作者有时还需依靠硅藻检验的分类结果推断死者溺水或落水的地点[19]，从而帮助警方还原案件真相或确定尸体来源。溺死者体内硅藻种类与其生前落水地点的水域中硅藻特征高度相似，通过比对硅藻种类及数量可以判断落水时的水域类型或水流速度等。CARBALLEIRA等[20]通过动物实验证实，应用硅藻形态学定性、定量分析结合Kullback-Leibler散度可以准确推断生物溺水地点。ZHAO等[21]对溺死动物组织及水样进行焦磷酸测序，通过检测18S rDNA V7高度可变区实现了对硅藻群落的准确分析并用于不同水源的鉴别。本研究所提出的PHP消解法相较于传统的硝酸破机法能够从肺组织中提取出更多的硅藻，硅藻数量趋近于溺液样本，硅藻回收率高达93.95%。此外，本研究还发现该方法对个别硅藻种属（菱形藻属Ⅱ）的提取造成损失，其数量略微低于水样，但该损失量不足以影响溺水或落水地点的推断。
随着人工智能（artificial intelligence，AI）技术的发展，该项技术已开始应用于各行各业，特别是在临床诊断、预后评估等方面[22-23]。法医学界许多学者[24-27]也提出了使用AI技术进行自动化硅藻识别，在实际溺水案例中硅藻检出的查准率达到了92.45%[28]，且相较于人工识别，AI技术对于微小的硅藻或硅藻碎片具有更高的敏感性。但是，AI硅藻识别需将实体样本涂片并通过数字切片扫描系统转化为全切片图像（whole slide image，WSI），而传统强酸消化制作的样本涂片会残留少量腐蚀性物质，对于仪器设备的长期维护、保养存在一定的成本负担，不利于数字智能化硅藻检验方法的广泛开展。于慧潇等[29]使用蛋白酶K消解法结合AI技术识别硅藻，识别准确率达97.65%。本研究所使用的木瓜蛋白酶及其他蛋白酶几乎均不会生成有毒、有害物质，在很大程度上对操作人员、仪器设备起到了保护作用。木瓜蛋白酶的消解能力虽不及蛋白酶K，但本研究所引入的过氧化氢处理步骤弥补了木瓜蛋白酶消解不充分的缺点且该类蛋白酶价格低廉，有利于在鉴定实践中推广。
综上所述，相较于单纯的酶消解法，PHP消解法能够更为充分地消解组织样本中的有机成分，且在硅藻回收率、硅藻碎片占比、环境保护等方面明显优于传统的强酸消化法，为法医病理学溺死诊断提供了一种更为可靠的检测方法。更为重要的是，其天然无害的试剂成分更利于数字化仪器设备的长期维护，为基于AI技术的硅藻检验方法奠定了良好基础。
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