生前损伤和死后损伤的鉴别是法医学实践中常见的问题，也是法医病理学检验的重要任务之一^[1]。对于新鲜尸体的生前损伤，可以根据生活反应相关指标进行鉴别，如神经递质水平升高^[2]、生物活性胺水平升高^[3]、细胞因子水平升高^[4]等。但是尸体腐败后，创口组织结构受到腐败影响，导致基于生活反应相关指标的传统方法难以鉴别生前损伤和死后损伤^[5]。

细菌广泛存在于人体的各个部位，并与人体形成复杂的共生关系^[6-7]。随着尸体腐败的进展，细菌群落结构也会发生时序性变化^[8]，反映了细菌群落与尸体腐败的动态演变过程^[9]。细菌群落结构分析不仅可以用于推断死亡时间，还可以进行个体识别和组织液体来源推断^[10-11]。但是细菌群落与损伤经历时间的相关报道较少。SANJAR等^[12]对大鼠皮肤烧伤后机体细菌的组成和多样性进行研究，发现健康皮肤和烧伤皮肤的细菌群落相对丰度不同，说明细菌群落也可以反映损伤带来的微环境改变。因此，基于细菌对环境改变的敏感性^[13]，生前损伤和死后损伤的创口细菌群落也可能产生差异^[14]。

本研究拟建立裸鼠的生前损伤和死后损伤模型，观察创口的大体表现、组织病理学改变以及细菌群落变化，分析腐败过程中生前损伤和死后损伤的形态学差异和细菌群落差异，为生前损伤和死后损伤的鉴别提供新的指标和方法。

为模拟尸体的自然腐败过程，引入土壤培养基。土壤采集于广东省广州市白云区，使用孔径为8 mm的筛网将土壤中的大块石头和树枝去除，再用镊子钳去除细小杂物，混匀土壤；在每个聚丙烯塑料盒（11 cm×11 cm×9 cm）内装入160 g土壤。然后将装有土壤的聚丙烯塑料盒放入20.0~22.0 ℃恒温箱内，每隔12 h称重（聚丙烯塑料盒和土壤的总质量），减少的质量用纯水补足；在恒温箱内放置5 d，使土壤中的细菌群落达到稳态^[8]。

如图1所示，在48只BALB/c裸鼠（6周龄，20~ 25 g，雌性，购自广东省医学实验动物中心）的腹部a处用无菌手术刀制作一个创口（记为生前损伤组），10 min后采用颈椎脱臼法处死裸鼠；死后4 h，在同一只裸鼠的腹部b处用无菌手术刀制作一个创口（记为死后4 h损伤组）；死后72 h，在同一只裸鼠的腹部c处用无菌手术刀制作一个创口（记为死后72 h损伤组）。创口长度均为1 cm，深达筋膜层。将制作创口后的裸鼠放在装有土壤的聚丙烯塑料盒中，并置于20.0~22.0 ℃恒温箱内。

分别在损伤形成后第1、3、5、8、11、15天随机选取8只裸鼠提取创口的擦拭子，将擦拭子置于收集管中，在液氮（广州市广气气体有限公司）中保存。提取擦拭子后，在创口剪取皮肤样本（长1.0~1.5 cm、宽2~3 mm）进行组织病理学检验。

本研究已获得中山大学实验动物伦理委员会的审批（审批文号：SYSU-IACUC-2021-000678）。

将10%甲醛溶液固定后的皮肤样本使用石蜡进行包埋。蜡块切片时，将皮肤组织样本朝上放置，制作4 μm厚切片。进行常规HE染色，于显微镜下放大40倍进行胞核和胞质的检查，然后在400倍下观察选定区域。

将擦拭子样本送至杭州联川生物技术股份有限公司进行16S rRNA测序。简要步骤如下：

（1）DNA提取。使用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）提取微生物组总DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，同时使用紫外-可见分光光度计（美国Agilent公司）对DNA进行定量。

（2）PCR扩增。选择针对16S rRNA基因的V3~V4高变区进行PCR，引物为341F（5'-CCTACGG GNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTA TCTAATCC-3'）。

（3）PCR反应。反应体系：Phusion^®热启动 Flex 2X Master Mix 12.5 μL，上下游引物各2.5 μL，DNA模板50 ng，用去离子水补至最终体积为25 μL。反应条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，由AMPure XP核酸纯化试剂盒（美国Beckman Coulter公司）纯化后，使用Qubit^TM 4荧光计（美国Invitrogen公司）进行定量。纯化后的PCR产物使用2100生物分析仪（美国Agilent公司）和KAPA文库定量试剂盒（美国KAPA Biosystems公司）进行评估。通过NovaSeq 6000基因测序仪（美国Illumina公司）对DNA片段进行双端测序，获得原始数据。

使用Cutadapt v1.2.1软件（https://cutadapt.read thedocs.io/）对原始测序数据进行处理，以去除接头序列。随后，使用FLASH v1.2.8软件（http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对双端测序得到的序列进行合并拼接，以同步并联合序列。使用滑窗法检查各个序列以对序列的质量值进行检查，接着利用fqtrim v0.9.4软件（https://ccb.jhu.edu/software/fqtrim/）进行低质量序列的去除以及数据的均一化处理，设定长度阈值为100 bp。之后，利用Vsearch v2.3.4软件（https://github.com/torognes/vsearch）进行嵌合体的检测并删除。使用QIIME 2软件（https://qiime2.org/）调用DADA2 R包进行长度过滤和去噪。获得扩增子序列变异（amplicon sequence variant，ASV）特征序列和ASV丰度表格，并去除仅出现1次的ASV特征序列。

基于得到的ASV特征序列和ASV丰度表格进行α多样性分析和β多样性分析。基于ASV特征序列文件，使用SILVA数据库（https://www.arb-silva.de/）和美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的16S rRNA序列数据（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行物种注释，注释的置信度阈值为0.7。在得到注释后，基于ASV丰度制作在界、门、纲、目、科、属、种等分类水平下的物种丰度表，然后通过比较各组间的物种组成分布分析细菌群落的差异。

使用R v4.3.0软件（https://www.r-project.org/）对各组样本每个时间点门水平和属水平排名前10的物种绘制柱状图，使用QIIME 2软件计算各样本的Shannon指数和Observed species指数，采用Kruskal-Wallis检验比较生前损伤组、死后4 h损伤组和死后72 h损伤组之间的α多样性（检验水准α=0.05），用R v4.3.0软件绘制小提琴图。使用R v4.3.0软件计算样本间Jaccard相似系数以构建距离矩阵，并进行主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），采用置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）检验组间菌群构成差异，并计算R²值。最后，利用线性判别分析效应大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe），以线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）值>2为阈值筛选门水平到属水平的差异性物种^[15]，LDA值越高代表其对组间差异的贡献越大。

生前损伤组的创口形成时即见活动性出血，量较多，稍后可见少量血凝块，创周皮肤肿胀；死后4 h损伤组的创口形成时见少量血液流出，局限在创腔内部，创周皮肤未见明显肿胀；死后72 h损伤组的创口形成时未见出血和肿胀。

3组创口在各时间点的大体表现见图2。损伤形成后第1天，生前损伤组的创口呈纺锤形，创角大，哆开明显；死后4 h损伤组的创口呈纺锤形；死后72 h损伤组的创口呈条形。损伤形成后第3天，生前损伤组和死后4 h损伤组的创缘有收缩现象，死后72 h损伤组的创缘未见收缩。损伤形成后第5、8天，3组创口均可见腐败现象，其中生前损伤组的腐败进展最快，创缘皮肤可见皮革样化；除形状差异外，3组创口的出血、肿胀等现象差异不明显。损伤形成后第11天，生前损伤组和死后4 h损伤组的创口腐败进展明显比死后72 h损伤组快，腐败程度更重。损伤形成后第15天，3组创口的腐败程度均较严重。

损伤形成后第1、3、5天，生前损伤组的创口可见局部皮肤组织连续性中断，皮下组织间有大量红细胞漏出，组织间隙可见渗出液，未见炎症细胞浸润；死后4 h损伤组和死后72 h损伤组的创口皮下组织未见红细胞漏出，仅观察到皮肤表皮层鳞状上皮细胞的坏死现象。损伤形成后第8天，3组创口的皮肤组织均表现为细胞崩解，细胞及组织结构变得模糊，细胞形态不完整。随着时间的推移，裸鼠尸体腐败进程加剧，组织结构破坏，导致损伤形成后第11天和第15天时3组的组织形态在镜下无法辨认。3组创口在损伤形成后各时间点的组织病理学表现见图3。

在门、属水平对细菌群落构成及分布丰度进行分析。在门水平，变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）是3组中相对丰度最大的细菌类型，且3组中排名前10的细菌类型基本相同。在死后4 h损伤组和死后72 h损伤组中，厚壁菌门在损伤形成后第1天为优势细菌，相对丰度分别为0.680 925 8和0.889 774 3；而到损伤形成后第3天，变形菌门成为优势门（图4A）。在属水平，生前损伤组的细菌群落整体呈现变形杆菌属（Proteus）逐渐增加、葡萄球菌属（Staphylococcus）逐渐减少的趋势。同时，在3组中排名前10的细菌类型基本相同，变形杆菌属和葡萄球菌属分别是变形菌门和厚壁菌门中的优势属（图4B）。

经Kruskal-Wallis检验，3组创口细菌群落的Shannon指数在损伤形成后第1、3、5天差异均无统计学意义；损伤形成后第8天，生前损伤组和死后72 h损伤组的Shannon指数差异具有统计学意义；损伤形成后第15天，生前损伤组与死后72 h损伤组、死后4 h损伤组与死后72 h损伤组的Shannon指数差异具有统计学意义（图5A）。在损伤形成后第8天，生前损伤组与死后4 h损伤组、死后4 h损伤组与死后72 h损伤组创口细菌群落的Observed species指数差异具有统计学意义；损伤形成后第11天，3组之间的Observed species指数差异均具有统计学意义（图5B）。

为了更好地展示细菌群落的β多样性，对损伤形成后第8、11、15天各组的Jaccard相似系数进行PCoA，发现生前损伤组与死后4 h损伤组、死后4 h损伤组与死后72 h损伤组之间差异均无统计学意义（图6A~C），而生前损伤组与死后72 h损伤组在第8、11、15天的Jaccard相似系数差异均具有统计学意义，两组数据随着时间的推移而逐渐分成两簇，PERMANOVA的R²值逐渐升高（0.22~0.61，图6D~F），提示微生物群落结构在不同组别之间的差异性越来越大。

使用LEfSe（LDA>2）筛选属水平的差异性物种发现，大部分排名前6的物种高度表达。为了方便观察，选择相对丰度排名前6的差异性物种进行展示，结果见图7。

损伤形成后第1天，3组创口细菌群落中未发现具有显著差异的物种。损伤形成后第3天，生前损伤组中差异性物种为棒状杆菌属（Corynebacterium）、罗氏菌属（Roseburia）和Snodgrassella属；死后4 h损伤组中差异性物种为不动杆菌属（Acinetobacter）、阿克曼菌属（Akkermansia）、布劳特氏菌属（Blautia）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）；死后72 h损伤组中差异性物种为变形杆菌属、Zhouia属、粪杆菌属（Faecalibacterium）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、巨大球菌属（Macrococcus）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）。损伤形成后第5天，生前损伤组中差异性物种为葡萄球菌属、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、链球菌属（Streptococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、考拉杆菌属、毛螺菌属（Lachnospira）；死后4 h损伤组的细菌主要为脱硫弧菌属、柠檬酸杆菌属、嗜冷杆菌属、巨大球菌属、埃希氏菌属（Escherichia）；死后72 h损伤组的细菌主要为变形杆菌属、阿克曼菌属、粪杆菌属、不动杆菌属。损伤形成后第8天，生前损伤组的细菌主要为棒状杆菌属、假单胞菌属（Pseudomonas）、劳尔氏菌属（Ralstonia）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、沙雷氏菌属（Serratia）、链球菌属；死后4 h损伤组的细菌主要为阿克曼菌属、脱硫弧菌属、嗜冷杆菌属。损伤形成后第11天，生前损伤组的细菌主要为粪杆菌属、链球菌属、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、罗氏菌属、毛螺菌属、肠球菌属（Enterococcus）；死后4 h损伤组的细菌主要为葡萄球菌属；死后72 h损伤组的细菌主要为乳酸杆菌属、摩根菌属（Morganella）、拟杆菌属（Bacteroides）、粪杆菌属、颤杆菌克属（Oscillibacter）、假单胞菌属等。损伤形成后第15天，生前损伤组的细菌主要为乳酸杆菌属、摩根菌属和双歧杆菌属等；死后4 h损伤组的细菌主要为葡萄球菌属、拟杆菌属、螺杆菌属（Helicobacter）；死后72 h损伤组的细菌主要为变形杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、香味菌属（Myroides）、脱硫弧菌属、乳球菌属（Lactococcus）等。

随着时间的推移，生前损伤组的微生物群落倾向于形成有益的保护性菌群，如链球菌属和乳酸杆菌属等；死后4 h损伤组的微生物群落由早期的不动杆菌属和阿克曼菌属主导转变为由葡萄球菌属主导；死后72 h损伤组则主要表现为变形杆菌属、假单胞菌属和不动杆菌属等厌氧分解菌群的显著增加。

在法医学鉴定实践中，判断损伤发生在生前还是死后对死亡原因的确定和案事件的定性具有重要意义。但是一直以来，对腐败尸体生前损伤和死后损伤的鉴别较困难。在本研究中，随着腐败的进展，从损伤形成后第8天开始，基于形态学的大体观察和组织病理学检验均难以区分生前损伤和死后损伤，说明形态学检查在腐败尸体损伤类型鉴别中存在较大的局限性^[5，16]。因此，基于微生物对微环境改变的敏感性^[13-14]，本研究探索了细菌群落差异分析在腐败尸体生前损伤和死后损伤鉴别中的作用。

在实验动物选择方面，本研究选择了BALB/c裸鼠作为实验动物，这是因为在前期的预实验中，发现大鼠和小鼠在腐败过程中会发生皮肤组织疏松以及毛发脱落，用拭子取样时容易沾染区域外的毛发及其连带的腐败皮肤组织。而BALB/c裸鼠体表无毛，拭子取样时不受毛发干扰，也不易被污染。

在尸体细菌的时序性变化方面，变形菌门和厚壁菌门是尸体腐败过程中最主要的菌群。生前损伤组创口变形菌门和厚壁菌门的相对丰度占比与既往研究^[17-18]结果大体一致，而死后形成创口的细菌群落则显示出不同的变化规律，特别是在损伤形成后的前3天，创口细菌群落已经完成了优势菌门的交替。这表明在死后损伤的创口中，细菌群落在最初几天内发生了剧烈的变化。这一差异可能与生前损伤引发的炎症反应有关，炎症细胞的浸润和炎症因子的释放可能限制了创口细菌群落的过度繁殖^[14]。而死后损伤的创口，由于缺乏此类炎症相关反应，加之开放性创口为细菌提供了有利的繁殖环境，促进了细菌群落的演替。因此，在腐败的早期阶段，死后损伤的两组创口细菌群落就已经展现出了优势菌门的交替现象。

损伤形成后第1、3、5天，在形态学上可以明显区分3组创口，而同一时期内的细菌群落Shannon指数和Observed species指数差异均无统计学意义。表明在此阶段，利用形态学检验可以区分生前损伤和死后损伤。在损伤形成后第8天，3组创口的形态学表现趋于一致，但细菌群落的Shannon指数和Observed species指数差异有统计学意义，尤其是生前损伤组和死后72 h损伤组创口的细菌群落结构表现出显著不同，可能是创口类型对细菌群落的多样性产生了影响。

通过进一步分析，损伤形成后第5天在生前损伤组发现了几种与损伤相关的差异性物种，包括葡萄球菌属和链球菌属，这些细菌与开放性创口和烧伤创口样本中观察到的情况相似^[19-20]，说明可能存在创伤后感染。在不同时间点发现的差异性物种，为生前损伤与死后损伤的区分提供了重要的生物学指标。但是在法医学实践中仍然需要保持谨慎，仅凭这些差异性物种进行鉴别可能不足以保证结果的准确性和可靠性，应当结合形态学和分子生物学证据进行综合评估。这些差异性物种的特异性和敏感性仍然需要在未来的研究中进一步验证。

土壤是腐败过程中微生物的主要来源之一，不同来源的土壤可能对腐败产生一定影响^[9]。本研究使用同一来源的土壤作为培养基，模拟相同土壤条件下的自然腐败，因此，没有考虑土壤差异对微生物演替的影响。本研究仅对生前损伤和死后损伤的创口细菌群落进行初步探索，也没有与体表其他部位或者创口周边细菌群落进行比较分析，存在一定的局限性。未来将进一步完善研究，为使用细菌群落多样性进行生前损伤和死后损伤的鉴别提供更全面和科学的依据。

综上所述，本研究结合创口的形态学检验和16S rRNA测序技术，分析了生前损伤和死后损伤的创口在腐败过程中的形态学表现和细菌群落特征，发现：（1）利用形态学检验可以区分早期腐败尸体的生前损伤和死后损伤；（2）在损伤形成第8天以后，形态学检验已经难以区分生前损伤和死后损伤，而创口细菌群落则开始出现显著差异；（3）细菌群落可以为晚期腐败尸体的生前损伤和死后损伤鉴别提供参考依据。本研究发现了细菌群落在鉴别生前损伤和死后损伤方面的潜力，在法医学实践中具有良好的应用前景。