依托咪酯［R-（+）-1-（1-苯乙基）-1-氢-咪唑- 5-甲酸乙酯，etomidate；分子结构见图1］是一种非巴比妥类全身麻醉剂，通过作用于γ-氨基丁酸A型（γ-aminobutyric acid-A，GABA-A）受体抑制中枢神经系统的反应，从而达到镇静催眠麻醉效果，并具有起效快、活性高、稳定性强等特点，被广泛用于危重疾病的麻醉诱导^[1-3]。随着公安机关打击力度的不断加大，管制的精神药品及麻醉药品越来越难获得。当前，依托咪酯常被不法分子添加于电子烟油中进行非法使用，特别是作为丙泊酚、合成大麻素、曲马多等药品的替代品，致使近年来国内外非法滥用依托咪酯的案件频频发生^[4-5]。

依托咪酯作为一种酯类化合物，进入人体后主要在肝内降解，其主要代谢产物为依托咪酯酸（分子结构见图2），进一步水解生成乙醇和羧酸，并最终随尿液或胆汁排出^[6-7]。研究^[8]发现，静脉注射依托咪酯后1 d内，近75%的依托咪酯从尿液中排出，其中极少部分是以原形形式。此外，针对依托咪酯的检测，有研究^[9-10]使用高效液相色谱法对血液中的依托咪酯进行检测，但该方法前处理操作繁琐，且灵敏度较低；有研究^[11]使用高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrome-try，HPLC-MS/MS）对尿液中的依托咪酯进行分析检测，尽管灵敏度较既往研究大幅提高，但该方法不仅对检材的利用率低，而且尿液样品仅通过超高速离心处理，对仪器性能要求较高。目前有关依托咪酯的检测多为原体检测，对代谢物涉及较少，如需推断给药时间，则要参考代谢物的实际情况^[12-13]。因此，以依托咪酯和依托咪酯酸为目标物，能够有效满足对人体内依托咪酯的定性定量测定要求，同时，尿液样品相对于血液、组织等检材而言更容易获取且前处理更为简单^[14]。

本研究旨在建立一种尿液样品中依托咪酯和依托咪酯酸的HPLC-MS/MS检测方法，并应用于实际案例，为依托咪酯药物滥用类案件的鉴定提供可靠的检测手段和实验数据。

Triple Quad™ 5500+三重四极杆液质联用系统—QTRAP™ Ready（美国AB Sciex公司），Multi Reax混匀器（德国Heidolph公司），BRANSON 1210超声波清洗机（美国Emerson公司），3-18K型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）。

甲醇、乙腈（均为HPLC级，美国Thermo Fisher Scientific公司），实验用超纯水由Milli-Q^® IQ 7003智能环保超纯水系统（德国Merck KGaA公司）制备，依托咪酯和依托咪酯酸标准品溶液质量浓度均为1.0 mg/mL（广州谱登生物科技有限公司）。

精确量取适量依托咪酯和依托咪酯酸标准品溶液，用甲醇稀释至0.1 mg/mL，密封，置于-20 ℃保存。实验中根据检测需求用甲醇对标准品溶液进行稀释，配制成系列浓度标准工作溶液。

取0.2 mL尿液于离心管中，加入0.8 mL乙腈，涡旋振荡5 min，超声处理5 min，以离心半径99 mm，10 000 r/min高速离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待分析。若实际尿液样品中目标物浓度过高，可用相同的空白基质稀释样品后进行检测。

色谱条件：使用ZORBAX SB-C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm；美国Agilent公司），柱温40 ℃，进样量2 μL，流速0.4 mL/min；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序见表1。

质谱条件：采用电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）正离子模式扫描，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式检测；电喷雾电压5 500 V；离子源温度500 ℃；气帘气（CUR） 40 psi，喷雾气（GS1） 55 psi，辅助加热气（GS2） 55 psi，均为高纯氮气。

本研究对所建方法的选择性、线性、检出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantitation，LOQ）、精密度、准确度、回收率、基质效应、稳定性、稀释可靠性进行验证^[15-16]，并应用于实际案例。

选择性：取10份不同来源的空白尿液样品，观察尿液中添加5 ng/mL依托咪酯和10 ng/mL依托咪酯酸的出峰情况，以确认目标物的保留时间是否存在干扰。

线性、LOD和LOQ：添加依托咪酯和依托咪酯酸标准工作溶液至空白尿液中，制成系列质量浓度添加样品，最终质量浓度分别达到0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL（依托咪酯）和1、2、5、10、20、50、100 ng/mL（依托咪酯酸）。按照1.3节方法处理后，在1.4节条件下，分别以添加的依托咪酯和依托咪酯酸质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，建立线性回归方程［选用权重系数（w）补偿异方差性，w=1/x²］。每个浓度点的添加样品独立重复5次，空白样品在最高浓度点后进样以评价残留效应。以信噪比（S/N）≥3时的样品最低质量浓度为LOD，以S/N≥10时的样品质量浓度为LOQ。

基质效应及提取回收率的计算公式如下：

式中，A为空白尿液按照1.3节方法处理后添加低（0.5 ng/mL）、中（5 ng/mL）、高（50 ng/mL） 3个质量浓度的依托咪酯溶液或低（1 ng/mL）、中（10 ng/mL）、高（100 ng/mL） 3个质量浓度的依托咪酯酸溶液所测得的峰面积；B为空白尿液先添加该3个质量浓度的依托咪酯或依托咪酯酸溶液，再按照1.3节方法处理后测得的峰面积；C为相应质量浓度的依托咪酯或依托咪酯酸标准品溶液所测得的峰面积。每个质量浓度点使用6个不同来源的空白尿液样品并重复进样 6次。若基质效应超出±25%，则应增加不同来源的空白样品考察基质效应是否对LOD、LOQ、准确度及精密度产生影响^[15-16]。

精密度为样品测定值的标准偏差与平均值的比值，准确度为测定的平均值与参考值的百分比。选取低（0.5 ng/mL）、中（5 ng/mL）、高（50 ng/mL） 3个质量浓度的依托咪酯溶液和低（1 ng/mL）、中（10 ng/mL）、高（100 ng/mL） 3个质量浓度的依托咪酯酸溶液制备质控样品，每天选取各质量浓度的样品配制6个质控样品分别进行测定，并连续平行操作3 d。日内准确度和日间准确度分别由1 d内测定的平均值和3 d内测定的平均值与相应参考值的百分比计算得出。日内精密度和日间精密度分别是1 d内和3 d内实验测定值的标准偏差与相应平均值的比值。准确度及精密度的检测结果应分别控制在85%~115%和±15%之内，LOQ水平时则在80%~120%和±20%之内^[15-16]。

稳定性主要考察冻融稳定性和长期稳定性。其中冻融稳定性考察低（0.5 ng/mL）、中（5 ng/mL）、高（50 ng/mL） 3个质量浓度的依托咪酯溶液（n=9）和低（1 ng/mL）、中（10 ng/mL）、高（100 ng/mL） 3个质量浓度的依托咪酯酸溶液（n=9），在-20 ℃下冷冻24 h，然后室温放置24 h融化，重复3个冻融循环后进行测定；长期稳定性考察低（0.5 ng/mL）、中（5 ng/mL）、高（50 ng/mL） 3个质量浓度的依托咪酯溶液（n=3）和低（1 ng/mL）、中（10 ng/mL）、高（100 ng/mL） 3个质量浓度的依托咪酯酸溶液（n=3），在-20 ℃下保存7 d、14 d及28 d后进行测定。

配制空白尿液添加样品（依托咪酯50 μg/mL和依托咪酯酸100 μg/mL）考察稀释可靠性。用空白尿液基质稀释该样品1 000倍，按照方法学验证中准确度和精密度的分析方法分析3个批次。

根据目标物的组分特征，在正离子模式下，1 µg/mL的标准溶液以10 µL/min的速度进行质谱信息采集。通过一级质谱模式得到其分子离子，优化去簇电压和碰撞能量，提高依托咪酯和依托咪酯酸离子对的响应效果，最终选择两对母离子/子离子对作为定性离子对。优化后的HPLC-MS/MS参数见表2，目标物在MRM模式下的碎片化结果见图3。

通过比较空白尿液和尿液中添加5 ng/mL依托咪酯和10 ng/mL依托咪酯酸标准混合溶液的总离子流色谱图（total ion chromatogram，TIC；图4A~B），可以确认空白尿液在目标物出峰位置无响应，尿液中的内源性物质对分析物的测定没有干扰。在本研究建立的分析方法下，根据TIC和MRM色谱图可以确认依托咪酯与依托咪酯酸的保留时间分别为5.27 min和3.19 min，其中依托咪酯的定量离子对和定性离子对分别为245.0/141.0和245.0/105.0（图4C），依托咪酯酸的定量离子对和定性离子对分别为217.1/95.0和217.1/105.0（图4D）。

依托咪酯和依托咪酯酸的线性范围、LOD和LOQ见表3。其中，依托咪酯的LOD为0.2 ng/mL、LOQ为0.5 ng/mL，依托咪酯酸的LOD为0.5 ng/mL、LOQ为1 ng/mL。

以尿液中添加依托咪酯的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标构建标准曲线，在0.5~50 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好（r=0.995 0）；以尿液中添加依托咪酯酸的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标构建标准曲线，在1~100 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好（r=0.998 8）；且依托咪酯在0.5~50 ng/mL和依托咪酯酸在1~100 ng/mL质量浓度范围内均未见残留效应。本研究所建方法的线性范围可满足法医毒物分析方法验证通则的需求，即线性方程的相关系数不小于0.99^[15]。

依托咪酯和依托咪酯酸在尿液样品中的基质效应、回收率和稳定性见表4。

在低、中、高3个质量浓度下，尿液中依托咪酯的基质效应在5.42%~18.47%范围内，依托咪酯酸的基质效应在7.11%~10.73%范围内。基质效应具体表现为共洗脱的生物基质对特征离子的增强或抑制作用^[17]，由于尿液中依托咪酯和依托咪酯酸的基质效应均大于0，可见尿液基质对依托咪酯和依托咪酯酸的检测起到一定的增强效应，但该基质效应均未超过25%^[15]，故对LOD、LOQ、准确度及精密度的检测并未产生重要影响。

在低、中、高3个质量浓度下，尿液中依托咪酯的提取回收率分别为96.64%、93.07%和84.25%，依托咪酯酸的提取回收率分别为107.43%、110.26%和97.82%，表明本研究的前处理方法对目标物的提取损失较小，并随着样品质量浓度的增加，提取回收率有轻微的降低。

依托咪酯的冻融稳定性和长期稳定性分别在98.49%~110.23%和89.84%~110.65%范围内，依托咪酯酸的冻融稳定性和长期稳定性分别在91.77%~103.68%和88.23%~105.79%范围内。

稀释可靠性考察中，含50 μg/mL依托咪酯的尿液样品稀释1 000倍后的准确度和精密度分别为93.72%和2.61%，含100 μg/mL依托咪酯酸的尿液样品稀释1 000倍后的准确度和精密度分别为98.26%和1.91%，均可满足生物样品分析的要求^[15-16]。

尿液中添加低、中、高3个质量浓度依托咪酯和依托咪酯酸的准确度和精密度见表5。其中依托咪酯的日内准确度和日内精密度分别在91.44%~110.80%和5.13%~9.35%范围内，日间准确度和日间精密度分别在95.18%~109.53%和1.16%~5.80%范围内；依托咪酯酸的日内准确度和日内精密度分别在95.66%~100.22%和0.56%~3.49%范围内，日间准确度和日间精密度分别在90.42%~107.24%和4.88%~10.08%范围内。上述结果均满足生物样品分析的要求^[15-16]。

按本研究方法对某地区一吸食过量依托咪酯死者的尿液样本进行处理及检测，成功检出依托咪酯和依托咪酯酸成分，经计算，该死者尿液中依托咪酯质量浓度为8.82 μg/mL，依托咪酯酸质量浓度为27.88 μg/mL。据报道^[18]，全血中依托咪酯的治疗质量浓度范围为0.35~0.66 μg/mL，作为静脉麻醉剂使用后在尿液中的质量浓度为6~11 ng/mL。上述结果为该死者生前服用过依托咪酯提供了客观证据。

本研究采用乙腈沉淀蛋白的方式对尿液样品进行前处理，建立了尿液中依托咪酯和依托咪酯酸的HPLC-MS/MS分析方法。该方法前处理简单、灵敏度高、线性范围宽，且选择性、准确度、精密度、稳定性等指标均满足生物样品定性定量分析要求，可应用于法庭科学领域尿液中依托咪酯和依托咪酯酸的检测。