溺死是导致人群意外死亡的第三大原因，水中尸体是法医学实践中常见的尸体类型之一^[1]。溺死过程中，水中浮游生物（如硅藻、蓝藻、水生气单胞菌等）随溺液进入肺泡，经受损的肺泡-毛细血管屏障进入血液循环，从而到达全身器官，因此，各器官中检出浮游生物可作为诊断溺死的可靠依据^[2]。

目前，硅藻仍是溺死相关浮游生物检验的主要对象。传统硅藻检验方法主要是人工通过光镜观察，对尸体器官组织中各种形态的硅藻进行定性定量分析。ZHAO等^[3]建立的微波消解-真空抽滤-自动扫描电子显微镜法（microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy，MD-VF-Auto SEM）法提高了硅藻的检出率及准确性，但受限于昂贵的仪器及对专业人员的强依赖性，该法未能得到广泛应用。此外，由于硅藻种类繁多，难以对部分无明显特征或形态相似度较高的硅藻进行区分，进一步凸显了形态学检验方法的局限性。

随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记为法医学溺死诊断提供了新思路。研究^[4-5]表明，通过rbcL基因、UPA基因、16S rDNA基因等基因位点检测硅藻、蓝藻在溺死诊断中具有可行性。UCHIYAMA等^[6]针对水生细菌构建了基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR检测体系，该体系灵敏度可达pg级别，在266例尸体样本中均成功检测出水生细菌。目前，浮游生物DNA检测主要基于实时荧光定量PCR检测平台或PCR联合毛细管电泳技术检测，具备实验操作简单、检测耗时短等特点，有利于溺死诊断实验室方法的推广与普及。

本研究拟采用MD-VF-Auto SEM法、浮游生物多重聚合酶链反应-毛细管电泳检测法（polymerase chain reaction-capillary electrophoresis，PCR-CE）及SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法（real-time quantitative PCR，qPCR），对溺死尸体及非溺死尸体的肺、肝、肾组织进行检验分析，比较3种方法的技术特点，为法医学实验室选择合适的浮游生物检验方法提供参考。

DNeasy^® PowerSoil^® Pro试剂盒、QIAGEN蛋白酶K（10 mL）均购自德国Qiagen公司，二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT，99%）购自上海麦克林生化科技有限公司，POP-4^TM聚合物及Hi-Di^TM Formamide（高度去离子甲酰胺）购自美国Thermo Fisher Scientific公司，热启动C-Taq酶、PCR反应预混液（Reaction Mix）和Maker SIZ-500均购自无锡中德美联生物技术有限公司，HiPlex Robustic SYBR Green Mix （ROX free）购自苏州新海生物科技股份有限公司，硝酸购自广州化学试剂厂，过氧化氢溶液（30%）购自德国Merck公司。

Sigma 1-16K冷冻微离心机（德国Sigma公司），Vortex-Genie 2涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司），Eppendorf ThermoMixer^® C混匀仪（德国Eppendorf公司），Milli-Q^® IQ 7000超纯水系统（德国Merck公司），GR60DP高压灭菌器（美国Zealway公司），QuantStudio^TM 7 Flex实时荧光定量PCR系统、Veriti^TM 96孔热循环仪、3500xL基因分析仪均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，Multiwave 7000超级微波消解仪［安东帕（上海）商贸有限公司］，HL-6多联真空抽滤仪（珠海黑马医学仪器有限公司），Phenom XL G2台式扫描电镜（荷兰Phenom公司），SBC-12小型离子溅射仪（北京中科科仪股份有限公司）。

本研究设置溺死组和非溺死组，所有实验样本均由广州市刑事科学技术研究所提供。本研究已通过南方医科大学生物医学伦理委员会审批（审批文号：南医伦审[2023]第102号）。

溺死组样本的纳入标准是经案情调查或有目击者支持溺死，且（或）尸体检验见溺死的病理特征。排除标准：（1）致命性机械性损伤及原发性器质性致死性疾病；（2）镇静催眠药、毒品、杀鼠药等常见毒（药）物中毒。获得212例溺死尸体，其中男性153例，女性59例，年龄范围在15~70岁，死亡时间不超过7 d。法医在系统尸体检验过程中记录尸体腐败征象，将出现腐败静脉网、腐败产生液体及气泡、“袖套样”脱落、巨人观等征象的尸体设为腐败尸体。另外，考虑到溺液直接接触待检器官会造成干扰，本研究纳入的腐败尸体样本不涉及胸腹腔裸露及白骨化尸体。

非溺死组样本的纳入标准：（1）医院外死亡；（2）尸体完整，无胸腔或腹腔破裂；（3）尸体发现位置离海边距离大于30 km；（4）具有明确的非溺死死因鉴定结果。30例非溺死尸体中，男性21例，女性9例，年龄范围在20~70岁，死因包括颅脑损伤、冠心病、主动脉破裂、失血性休克等。

根据《法庭科学 硅藻检验技术规范 微波消解-真空抽滤-显微镜法》（GA/T 1662—2019）^[7]提取肺、肝、肾组织样本，将样本置于-80 ℃冰箱冷冻保存以进一步检验。每例分别提取肺组织2 g、肝组织10 g、肾组织10 g，用于MD-VF-Auto SEM法检验。每例再分别提取肺组织、肝组织、肾组织各0.5 g，进行浮游生物DNA提取，提取后的DNA用PCR-CE法及qPCR法检验。

将提取的0.5 g肺、肝、肾组织剪碎后，分别置于2 mL微量离心管中，加入10 μL蛋白酶K、10 μL DTT及800 μL细胞裂解液，涡旋混匀；56 ℃下，1 400 r/min，振荡2 h。若裂解不充分，向上述离心管中加入研磨珠，于涡旋振荡器最高转速下振荡10~15 min。依据DNeasy^® PowerSoil^® Pro试剂盒操作指南提取DNA。

参考前期研究^[8]构建的浮游生物qPCR体系，针对硅藻、蓝藻、水生气单胞菌，筛选出4对引物进行qPCR检测（表1）。

采用20 μL qPCR反应体系：HiPlex Robustic SYBR Green Mix 10 μL，正向引物及反向引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，超纯水7 μL，在QuantStudio^TM 7 Flex实时荧光定量PCR系统进行qPCR扩增反应。扩增条件：95 ℃ 300 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，40个循环；95 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s，收集荧光信号绘制熔解曲线。

前期研究^[9]构建的浮游生物多重PCR-CE体系包含12对引物（表2），目标物种对应硅藻、蓝藻、水生气单胞菌。将引物分为两组，分别用FAM和HEX荧光标记。

采用10 μL PCR反应体系：Reaction Mix（PCR反应预混液） 4.0 μL，引物2.0 μL，热启动U-Taq酶0.4 μL，模板DNA 1.0 μL，加超纯水补充体系至10.0 μL。PCR扩增条件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

采用3500xL基因分析仪进行毛细管电泳分离，使用GeneMapper ID-X 1.4软件（美国Scientific Industries公司）分析结果。取PCR扩增产物1.0 μL、Maker SIZ-500 0.5 μL和高度去离子甲酰胺10.0 μL，混匀离心，上样检测。

将提取的肺、肝、肾组织分别置于消解管中，加入8 mL硝酸和2 mL 30%过氧化氢溶液后置于Multiwave 7000超级微波消解仪中消解。程序设定：5 min内功率由0 W升至800 W，保持10 min；停止消解，强风冷却30 min；消解管中加入50 mL超纯水稀释其酸度。采用HL-6多联真空抽滤仪富集硅藻，真空度为50.0 kPa。取出滤膜烘干。

将滤膜粘于硅藻样品座（珠海市祥臻生物科技有限公司）表面，在SBC-12小型离子溅射仪中镀金属膜，控制膜厚为10~30 nm。将样品座置于扫描电镜下观察，记录硅藻的种类及数量。

MD-VF-Auto SEM法中，肺（肝或肾）组织于电镜下观察到硅藻即判定为该组织硅藻检出阳性。浮游生物多重PCR-CE法中，肺（肝或肾）组织检出浮游生物基因特异性片段（荧光值大于150 RFU），即判定为该组织检出对应浮游生物。SYBR Green Ⅰ qPCR法中，如肺（肝或肾）组织Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线和熔解曲线，判定为该组织中存在溺死相关浮游生物。在肺组织检出硅藻的基础上，肝、肾任一组织检出硅藻即鉴定为溺死。

根据数据分布类型，采用SPSS 26.0软件（美国IBM公司）中Fisher精确性检验方法对3种水中浮游生物检测方法的检出率差异进行统计学分析，检验水准α=0.05。

溺死组212例尸体的肺、肝、肾组织检测结果显示，MD-VF-Auto SEM法的总检出率为95.3%。其中，肺组织中均可检出硅藻，含量为（209 974.05±385 845.66）个；肝组织的检出率达到88.2%，硅藻含量为（643.01±4 112.65）个；肾组织的检出率可达92.9%，硅藻含量为（1 410.07±12 001.27）个。其中10例尸体仅在肺组织检出硅藻，而肝、肾组织中均未检出硅藻，故这些案例不能被鉴定为溺死（表3）。212例溺死尸体中有170例属于腐败尸体，其肺、肝、肾组织中硅藻的检出率分别为100.0%、88.8%、94.7%，总检出率为96.5%（表4）。

浮游生物多重PCR-CE法检测212例溺死尸体的总检出率为93.9%。其中，肺组织平均检出（6.92±3.98）个基因位点，检出率达95.8%；肝组织平均检出（3.08±3.01）个基因位点，检出率为92.0%；肾组织平均检出（3.92±3.51）个基因位点，检出率为90.6%（表3）。在170例腐败尸体中，肺、肝、肾组织中浮游生物的检出率分别为94.7%、90.6%、88.8%，浮游生物多重PCR-CE法的总检出率为92.4%（表4）。溺死尸体肺、肝、肾组织的典型基因分型图谱如图1所示。

SYBR Green Ⅰ qPCR法检测212例溺死尸体的总检出率为96.2%。其中，205例肺组织可出现典型扩增曲线，检出率可达96.7%；199例肝组织出现典型扩增曲线，检出率可达93.9%；204例肾组织出现典型扩增曲线，检出率可达96.2%（表3）。在170例腐败尸体中，肺、肝、肾组织中浮游生物的检出率分别为96.5%、92.9%、95.3%，SYBR Green Ⅰ qPCR法的总检出率为95.9%（表4）。溺死尸体肺、肝、肾组织的典型扩增曲线及熔解曲线见图2。

3种方法检测212例溺死尸体的总检出率均处于较高水平，其中总检出率最高的方法为SYBR Green Ⅰ qPCR法（P>0.05）。对于肺组织，检出率最高的方法为MD-VF-Auto SEM法，与浮游生物多重PCR-CE法、SYBR Green Ⅰ qPCR法相比，检出率之间的差异均有统计学意义（P<0.05）；对于肝、肾组织，检出率最高的方法为SYBR Green Ⅰ qPCR法（P>0.05）。值得注意的是，MD-VF-Auto SEM法的结果中，有10例溺死尸体被判定为阴性结果，其原因是在肺组织中检出硅藻，但肝、肾组织中均未能检出硅藻；而浮游生物多重PCR-CE、SYBR Green Ⅰ qPCR法在这10例尸体的肝、肾组织中虽也未能检出硅藻生物，但可以检出蓝藻、水生单胞菌等其他浮游生物的基因位点。此外，170例腐败尸体的检出情况与溺死组整体检出情况一致，MD-VF-Auto SEM 法在肺组织中的检出率高于SYBR Green Ⅰ qPCR法、浮游生物多重PCR-CE法（P<0.05），3种方法在肝、肾组织中硅藻检出率及溺死总检出率间差异无统计学意义（表4）。

对非溺死组30例尸体的肺、肝、肾组织进行检验，MD-VF-Auto SEM法在各例肺组织中均未检出硅藻，11例肝组织中检出硅藻（2~10个/10 g），13例肾组织中检出硅藻（2~9个/10 g）；浮游生物多重PCR-CE法与SYBR Green Ⅰ qPCR法在所有肺、肝、肾组织中的浮游生物基因检验结果均为阴性。MD-VF-Auto SEM法在肝组织、肾组织中的检出率与浮游生物多重PCR-CE法、SYBR Green Ⅰ qPCR法相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。

强酸消解-离心富集-光镜检验法因检测成本低、易操作而成为溺死诊断最常用的方法，但存在回收率低、强酸化学危害高等不足^[10-11]。MD-VF-Auto SEM法虽然提高了硅藻检验的检出率，但仪器价格昂贵，难以在基层单位广泛应用^[3]。近年来，浮游生物DNA检测技术逐步应用于溺死诊断^[12-14]。SUTO等^[15]采用PCR法从溺死家兔中检出硅藻EG1、EG2、SK1和SK2等叶绿素相关基因；AOYAGI等^[16]使用PCR方法检出溺死尸体中温和气单胞菌DNA以诊断溺死；KANE等^[17]针对蓝藻的16S rDNA基因设计特异性引物，通过PCR及测序从溺死尸体中成功检出蓝藻。上述PCR技术诊断溺死多针对浮游生物单基因或单一物种检测，本研究针对rbcL、UPA、rPOD、16S rDNA、AER-A、HLYA等基因位点，构建浮游生物多重PCR-CE法及SYBR Green Ⅰ qPCR法，实现了硅藻、蓝藻、气单胞菌的同步检测，提高了浮游生物的检出率。

本研究对212例溺死尸体的肺、肝、肾组织进行浮游生物检验，MD-VF-Auto SEM方法、浮游生物多重PCR-CE法及SYBR Green Ⅰ qPCR法在溺死尸体各组织浮游生物的检验中均具有较高的检出率，其中MD-VF-Auto SEM法在肺组织中的检出率最高（P<0.05），而3种方法在肝、肾组织中的检出率差异无统计学意义。值得注意的是，通过MD-VF-Auto SEM法，有10例溺死尸体仅在肺组织中检出大量硅藻，而肝及肾中未见硅藻，故被错误鉴定为非溺死。尽管结合案情、尸体检验以及肺组织和水的硅藻含量比值^[18]等信息可对死因进行准确的综合判断，但该类溺死尸体仍给SEM法带来一定挑战。相比之下，PCR-CE法和qPCR法在该10例溺死尸体的肝、肾组织中检出蓝藻及气单胞菌的相应基因，故可判定为溺水死亡。由此说明，浮游生物DNA检验方法能同时检测硅藻、蓝藻及气单胞菌等多种浮游生物，可以作为硅藻形态学检验方法的良好补充。联合形态学和DNA两类检测方法，212例溺死尸体均可判定为溺死，说明多方法联合检测可以进一步提高浮游生物的检出率，增强了浮游生物检验方法诊断溺水的证据力。

尸体腐败过程中，内源性微生物的扩散、pH值的变化、有害分解物质的产生等都可能对外源性浮游生物产生影响，造成浮游生物死亡及DNA降解。目前，关于腐败对水中尸体浮游生物DNA检验影响的研究尚少，KAKIZAKI等^[19]曾在1例溺死高度腐败尸体的血样中成功检出浮游细菌。本研究对170例腐败检材的检验中（表4），SEM法在肺组织中浮游生物的检出率高于浮游生物多重PCE-CE法及SYBR Green Ⅰ qPCR法，肺组织检出率与浮游生物多重PCR-CE法、SYBR Green Ⅰ qPCR法相比差异具有统计学意义（P<0.05），但在肝、肾组织中的检出率以及方法的总检出率差异无统计学意义。由此说明，即使对于腐败检材，浮游生物多重PCR-CE法及SYBR Green Ⅰ qPCR法仍能保持较高的检出率，与MD-VF-Auto SEM法基本一致，两种DNA检验方法在腐败检材中亦具有较高的检验能力。

MD-VF-Auto SEM法在部分非溺死尸体肝、肾组织中检出了少量的硅藻（2~9个/10 g），而浮游生物多重PCR-CE法和SYBR Green Ⅰ qPCR法在各组织浮游生物检验结果均呈阴性，这可能与浮游生物的活性丧失导致DNA降解有关。当浮游生物通过生活、工作环境^[20-21]及饮食^[22-23]等途径在人体内沉积，其活性随时间逐渐减弱，DNA发生降解，故DNA检验方法不易受生前吸入沉积的浮游生物干扰。MD-VF-Auto SEM法检验的对象是硅藻坚硬的硅质外壳，即使硅藻活性丧失，其外壳仍可在电镜下检出，造成非溺死尸体“假阳性”结果。值得注意的是，形态学检验在部分溺死尸体的肺、肝或肾组织中检出硅藻，但DNA方法未能检出。除浮游生物的活性因素外，还可能与检测体系有限的浮游生物物种覆盖范围及取材部位差异相关。本研究中两种DNA方法虽为复合体系，但其引物的目标物种为华南水域的常见浮游生物，未覆盖所有浮游生物，可能造成溺死诊断的假阴性结果。此外，与MD-VF-Auto SEM法相比，两种DNA方法仅提取0.5 g检材，由于浮游生物随溺液进入人体后，在器官或组织中未均匀分布^[24]，取材部位差异可能会造成漏检。因此，在检材提取时，应选择提取组织深部的多个位置，尽可能减少取材位置差异对结果造成的影响。

系统评估3种浮游生物检验方法的特点及适用性，从检材需求量、仪器设备、目标物种、安全性和检验时长等方面进行比较（表5）。MD-VF-Auto SEM法具有组织消解彻底、硅藻回收率高、定性定量分析准确等优点，但受限于仪器设备和检测人员的专业性而难以在基层普及。PCR-CE法和qPCR法所需检材量少、安全性高，多靶点检测、耗时短，且因基层单位基本配备毛细管电泳检测平台，便携式实时荧光PCR仪已发展成熟，故两种浮游生物DNA检测方法均具备向基层单位推广应用的基础条件。

综上所述，对于基层办案单位，可优先考虑使用浮游生物多重PCR-CE法或SYBR Green Ⅰ qPCR法对水中尸体进行快速的溺死诊断。对高度可疑的溺死案件，若DNA检测方法呈阴性结果，应考虑DNA降解、微量检材取样位置差异等因素的影响，需使用MD-VF-Auto SEM法对检材进行补充检验，以确保鉴定意见的准确性。