STR作为继限制性片段长度多态性之后的第二代遗传标记，自20世纪90年代以来被广泛应用于法医物证学的相关研究及鉴定，是目前应用最广泛的遗传标记之一^[1]。与其他遗传标记相比，STR基因座片段小、容易扩增，且多个STR基因座可以同时进行复合扩增，具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点^[2]。然而，在案件现场检材的鉴定过程中，DNA分子结构降解、含量降低，极易影响样本的检测与分型。如何对降解的生物检材进行有效的DNA检测已经成为法医DNA检测的难题之一^[3-5]。研究^[6-8]证明，mini-STR可有效提高降解样本的检出与分型。mini-STR需保证扩增片段足够小，才能较好地检出降解样本。目前主流的六色荧光mini-STR试剂盒可容纳的基因座一般不超过16个，整体识别能力不高，无法通过一次检测获得足够多的有效信息^[7，9]。本研究拟通过八色荧光标记技术^[10-11]，构建26个基因座的复合扩增体系，所有基因座扩增片段都在310 bp以内，以提高对降解样本分型的检出率。

男性DNA标准品9948、女性DNA标准品9947A购自美国Promega公司。收集113份无关个体血样采集卡样本、5份2016年陈旧血样采集卡样本和118份案件检材样本，所有人体样本均为实验室日常检案备份检材；种属特异性样本包括牛、羊、猪、狗、猫、鸡、鸭、鱼，所有种属特异性样本均从市场购得的动物离体组织中提取获得。

本研究已通过中国医科大学医学伦理委员会的审查。

案件专用磁珠法DNA提取试剂盒（手工）购自长春市博坤生物科技有限公司，脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）、VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒、ProFlex^TM PCR系统（96孔）、QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统购自美国Thermo Fisher Scientific公司，人类DNA定量检测试剂盒、AGCU EX25荧光检测试剂盒、AGCU Y37+5荧光检测试剂盒、内标AGCU SIZ-600购自江苏安科华捷生物科技有限公司，Honor1824法医遗传分析仪购自南京溯远基因科技有限公司。

本研究的复合扩增体系包含与VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒相同的23个常染色体STR基因座，以及Y染色体基因座DYS391、rs2032678和性别基因座Amelogenin（表1）。使用Premier 5.0软件（加拿大Premier公司）和Oligo 7软件（https://www.oligo.net/）进行引物设计（表2），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司、北京擎科生物科技股份有限公司、通用生物（安徽）股份有限公司合成。根据Honor1824法医遗传分析仪的荧光通道性能，结合荧光染料的光谱特性与检测效率，选用FAM、HEX、TET、SUM、LYN、PUR、H13、SIZ作为荧光染料标记，其中SIZ作为分子量内标，其余七色荧光分别标记各基因座引物。

最适PCR扩增条件：PCR扩增体系为25 μL，包含10 μL扩增缓冲液［由5 mmol/L的Mg²⁺、0.5 mmol/L的脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）、5.0 U的热启动Taq DNA聚合酶、4.5 mg/mL的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、 125 mmol/L的Tris-HCl、100 mmol/L的KCl、25 mmol/L的甜菜碱、5%的甘油、0.1%的ProClin^TM 950防腐剂组成］、5 μL八色荧光mini-STR引物（按表2的引物浓度进行配制，仅包含引物与水）以及0.1~1.0 ng的基因组DNA，纯水补至25 μL。热循环参数为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，59 ℃ 90 s，循环29次；60 ℃ 15 min；4 ℃保温。

使用荧光标记引物扩增113份无关个体血样，筛选并收集涵盖26个基因座不同等位基因的样本。使用非荧光标记引物对收集到的样本进行单基因座扩增，并使用分子克隆技术和碱裂解法制备26个基因座各等位基因的重组质粒；以质粒为模板，使用每个基因座对应的荧光标记引物分别进行PCR扩增并混合扩增产物，经组合调平最终制成等位基因分型标准物。同时，基于该等位基因分型标准物建立相应的基因分型分析方法。

取1 μL PCR产物、12 μL去离子甲酰胺和0.5 μL AGCU SIZ-600混匀，95 ℃加热3 min并立即冰浴 3 min。使用Honor1824法医遗传分析仪进行电泳，电泳数据通过Gene Manager 2.0分析软件（南京溯远基因科技有限公司）进行等位基因分型。

选用标准品9948、标准品9947A和113份无关个体血样，分别使用本复合扩增体系、AGCU EX25荧光检测试剂盒、AGCU Y37+5荧光检测试剂盒进行分型检测，对其中相同的基因座进行比较，验证分型的准确性。

选用标准品9948，扩增模板量设置为0.50、0.25、0.125、0.10、0.05、0.03 ng，使用本复合扩增体系进行扩增，每个模板量重复3次，根据各基因座的检出率评估本复合扩增体系的最低检出限。

选取种属特异性样本（牛、羊、猪、狗、猫、鸡、鸭、鱼），使用本复合扩增体系进行扩增及分型检测，根据是否检出非特异峰来评估本复合扩增体系的种属特异性。

选取不同浓度的抑制剂分别加入含有0.5 ng标准品9948 DNA模板的扩增体系中，统计各基因座的检出率，评估本复合扩增体系的抑制剂耐受能力。抑制剂共有6种：血红素（200、300、400、500、600 μmol/L）、血红蛋白（100、200、300、400、500 μmol/L）、靛蓝（10、15、20、25、30 mmol/L）、腐殖酸（30、60、90、120、150 ng/μL）、Ca²⁺（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA；0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L）。以上6种抑制剂的每个浓度各重复3次。

对标准品9948与标准品9947A分别定量，将两者按不同比例（19∶1、9∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、 1∶9、1∶19）进行混合，总量为1 ng，采用本复合扩增体系重复扩增3次，评估本复合扩增体系对于混合样本的扩增能力。

通过两种方法制备降解样本。（1）使用标准品9948，通过加速降解的方法制备降解样本。使用高温加热与核酸内切酶酶切加速降解，将10 μL质量浓度为1 ng/μL的标准品9948在95 ℃下恒温加热3 h或加入0.1 U的DNaseⅠ在15 ℃下反应1 h，两种方式各重复5次，使用人类DNA定量检测试剂盒对降解后的DNA样本进行定量检测，测试其降解程度。（2）使用陈旧的血样采集卡样本进行DNA提取获得降解样本。取5份2016年的血样采集卡，用案件专用磁珠法DNA提取试剂盒提取DNA。

将采用上述方法获得的降解样本用人类DNA定量检测试剂盒在QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统上检测降解样本的小片段扩增子（small fragment amplicon，SA）与大片段扩增子（large fragment amplicon，LA）含量。其中，SA的片段长度为76 bp，反映人类总DNA；LA的片段长度为271 bp，反映大片段DNA。通过SA与LA的比值评估DNA降解程度，比值越高，DNA降解越严重（表3）。

使用本复合扩增体系和VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒分别扩增制备好的降解样本及对照样本（0.5 ng的标准品9948），每个样本重复3次，比较两者的扩增效果及检出情况。

对118份案件样本（15份血迹、21份烟蒂、18份精斑、16份肋软骨、48份接触性棉签拭子），分别使用本复合扩增体系和VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒进行平行扩增检验。

采用本复合扩增体系对标准品9948、标准品9947A和113份无关个体血样进行分型检测，均能得到完整分型，并且与AGCU EX25荧光检测试剂盒和AGCU Y37+5荧光检测试剂盒相同基因座的分型结果完全一致，表明本复合扩增体系具有良好的准确性，可对样本基因座进行正确分型。

模板量0.50、0.25、0.125、0.10、0.05 ng的标准品9948在3次重复扩增中所有基因座均可完全检出且分型正确；模板量0.03 ng的标准品9948在2次重复扩增中所有基因座均可检出且分型正确，1次重复扩增中D6S1043及D7S820基因座出现分型缺失，其余基因座可检出且分型正确。

使用本复合扩增体系对种属特异性样本（牛、羊、猪、狗、猫、鸡、鸭、鱼）进行检测，在分型检测范围内未检测出峰。

通过在标准品样本中加入不同浓度的抑制剂，测试本复合扩增体系的抑制剂耐受能力。本复合扩增体系的抑制剂耐受能力如下：血红素浓度为 500 μmol/L、血红蛋白浓度为300 μmol/L、靛蓝浓度为25 mmol/L、腐殖酸质量浓度为120 ng/μL、Ca²⁺浓度为1.2 mmol/L、EDTA浓度为1.2 mmol/L时，开始丢失基因座分型。

对标准品9948与标准品9947A的混合样本进行分型检测，结果显示，在主要成分与次要成分混合比例为4∶1、2∶1、1∶1时，主要成分与次要成分均可获得较为均衡且明确的分型；在主要成分与次要成分混合比例达到9：1时，主要成分占明显优势、可完全检出，次要成分中有24个（92.31%）基因座可检出，D12S391、D7S820出现漏检；在主要成分与次要成分混合比例达到19∶1时，主要成分占绝对优势、可完全检出，次要成分仅15个（57.69%）基因座可检出。

对于标准品9948，本复合扩增体系与VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒均可扩增出完整分型，且均衡性良好，扩增0.5 ng的标准品9948，峰高都在8 000 RFU左右。对于高温处理的降解样本，本复合扩增体系可检出全部基因座且分型准确，26个基因座的检出率为100%；VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒在基因座D6S1043、D18S51、D5S818、D10S1248、Penta E、D2S1338、TPOX存在丢失情况，24个基因座的平均检出率为83.33%。对于酶切处理的降解样本，本复合扩增体系26个基因座的平均检出率为69.23%，VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒24个基因座的平均检出率为58.33%。对于陈旧样本提取的降解样本，本复合扩增体系26个基因座的平均检出率为92.31%，VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒24个基因座的平均检出率为91.67%。使用本复合扩增体系和VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒检验同一降解样本的STR图谱见图1。

对于血迹、烟蒂、精斑、肋软骨这类常规案件检材，本复合扩增体系和VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒的检出率均为100%（70/70）；对于棉签拭子，使用本复合扩增体系的检出率为31.25%（15/48），VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒的检出率为29.17%（14/48）。

DNA降解是细胞死亡后的必然结果。细胞死亡后，内源性核酸酶与溶酶体释放的水解酶共同作用，驱动DNA逐步降解。复杂的案件现场环境往往会导致这一情况进一步加剧，部分案件样本DNA已降解且含量极低。目前国内实验室常用的商品试剂盒主要为五色、六色荧光标记常染色体STR试剂盒，基因座扩增子最大片段在500 bp左右，面对此类降解、微量等疑难检材，较长的扩增片段会显著降低扩增效率，制约整体的检出能力，导致部分大片段位点分型不均衡或出现等位基因丢失。部分试剂盒通过mini-STR技术，缩短个别基因座扩增子的片段长度，优化STR基因座的排列分布，从而有效提高了现场检材的检验效率，但是受限于六色的荧光通道，无法容纳更多基因座，试剂盒整体识别能力较低^[4-7，9]。随着八色荧光标记技术的出现，荧光通道的数量得以增加，使得多位点的mini-STR试剂盒成为可能。

本研究的检测系统依托国产八色荧光检测平台，结合mini-STR技术，对23个常染色体STR基因座、DYS391、rs2032678以及Amelogenin的核心重复区重新设计mini-STR片段引物，将26个基因座的长度有效控制在310 bp以内，不仅包含日常检案的常染色体STR核心位点，同时包含DYS391、rs2032678等基因座，有助于混合数据的分析，并避免了Amelogenin位点中Y等位基因丢失导致分型错误的风险。同时，通过优化PCR缓冲体系、添加内部控制片段，有效提高了现场生物物证的检出率，避免了抑制剂、微量降解等因素导致的大片段分型不均衡或等位基因丢失现象。

针对mini-STR因扩增片段缩短所引发的侧翼序列差异而可能导致的不同复合扩增体系间分型结果不一致的问题，本复合扩增体系在引物设计阶段收集了大量基因座序列信息，避免已知的侧翼序列的突变，在性能验证阶段，对113份无关个体血样与标准品DNA进行不同扩增体系的分型一致性验证，本复合扩增体系暂未发现分型不一致的情况。

另外，使用本复合扩增体系与VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒同时扩增降解样本并进行对比，发现对于3种方式获得的降解样本，本复合扩增体系的基因座检出率分别为100%、69.23%、92.31%，高于VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒的83.33%、58.33%、91.67%，本复合扩增体系在降解样本检出率方面存在优势。应用到实际案件样本的检测中，受现场检材复杂性的限制，本复合扩增体系在接触性样本的检测中整体检出率不高，但仍高于VeriFiler^TM Plus PCR扩增试剂盒。

综上所述，通过mini-STR技术与八色荧光标记技术构建的复合扩增体系在微量、降解等检材的DNA检验中具有广阔的应用前景。