HPLC-MS/MS法检测尿液中依托咪酯及依托咪酯酸

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2023.330702

摘要/Abstract

摘要：

目的建立一种尿液样品中依托咪酯和依托咪酯酸的高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）检测方法。方法待测尿液样品中加入乙腈沉淀蛋白，离心后取上清液过膜，使用C₁₈色谱柱进行分离，流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈，以0.4 mL/min的流速梯度洗脱。采用电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）正离子模式扫描，多反应监测模式检测。通过选择性、线性、检出限等技术参数验证后，应用于1例依托咪酯中毒死亡案例。结果尿液样品中依托咪酯和依托咪酯酸的检出限分别为0.2和0.5 ng/mL，定量限分别为0.5和1.0 ng/mL，线性范围内线性关系良好（r>0.995 0）。在低、中、高3个质量浓度水平（依托咪酯：0.5、5、50 ng/mL；依托咪酯酸：1、10、100 ng/mL），基质效应在5.42%~18.47%范围内，提取回收率大于84.25%，稳定性大于88.23%，准确度、精密度和稀释可靠性均满足实验要求。采用本方法从吸食过量依托咪酯死者的尿液中成功检出依托咪酯和依托咪酯酸，质量浓度分别为8.82和27.88 μg/mL。结论该方法前处理简单、灵敏度高、线性范围宽，适用于法庭科学领域尿液样品中依托咪酯和依托咪酯酸的检测。

关键词: 法医学, 毒物分析, 依托咪酯, 依托咪酯酸, 高效液相色谱-串联质谱法, 尿液

Abstract:

Objective To establish a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） method for the detection of etomidate and etomidate acid in urine samples. Methods Protein in the urine samples was precipitated by adding acetonitrile, and the supernatant was obtained after centrifugation and filtered. The supernatant was separated on a C₁₈ column with a mobile phase consisting of 0.1% formic acid solution and acetonitrile at a flow rate of 0.4 mL/min. The detection was performed in positive electrospray ionization （ESI） and multiple reaction monitoring （MRM） modes. The method was validated for selectivity, linearity and limit of detection （LOD）, and applied to a case of etomidate poisoning death. Results The LOD of etomidate and etomidate acid were 0.2 and 0.5 ng/mL, respectively, and the limit of quantitation （LOQ） were 0.5 and 1.0 ng/mL, respectively. Good linear relationship was observed within the linear range （r>0.995 0）. At three concentration levels （0.5, 5, 50 ng/mL for etomidate and 1, 10, 100 ng/mL for etomidate acid）, the matrix effect was within the range of 5.42% to 18.47%, the extraction recovery rate was greater than 84.25% and the stability was greater than 88.23%. The accuracy, precision and dilution reliability all met the experimental requirements. Etomidate and etomidate acid were successfully detected with the concentrations of 8.82 and 27.88 μg/mL in the urine of a deceased individual who had consumed excessive etomidate. Conclusion The method has simple pretreatment, high sensitivity and wide linear range, which can be applied to the detection of etomidate and etomidate acid in urine samples in forensic science.

Key words: forensic medicine, toxicological analysis, etomidate, etomidate acid, high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）, urine

中图分类号:

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图/表 9

图1 依托咪酯的分子结构图

Fig. 1 Molecular structure diagram of etomidate

图2 依托咪酯酸的分子结构图

Fig. 2 Molecular structure diagram of etomidate acid

表1 梯度洗脱程序 (%)

Tab. 1 Gradient elution procedure

时间/min	流动相A	流动相B
0.01	95	5
1	95	5
8	5	95
9	5	95
9.01	95	5

表2 优化后的依托咪酯和依托咪酯酸HPLC-MS/MS分析参数

Tab. 2 The optimized HPLC-MS/MS parameters of etomidate and etomidate acid

目标物	保留时间/min	母离子（m/z）	子离子（m/z）	去簇电压/V	碰撞能量/eV
依托咪酯	5.27	245.0	141.0^1）	40.0	15.5
			105.0	40.0	35.0
依托咪酯酸	3.19	217.1	95.0^1）	28.0	32.0
			105.0	28.0	33.0

图3 目标化合物在MRM模式下的碎片化结果A：依托咪酯；B：依托咪酯酸。虚线表示目标物离子化碎片的断键方式。

Fig. 3 Fragmentation of target substances under MRM mode

图4 尿液样品的TIC和MRM色谱图A：空白尿液的TIC图；B：空白尿液中添加5 ng/mL依托咪酯和10 ng/mL依托咪酯酸标准混合溶液的TIC图；C：空白尿液中添加5 ng/mL依托咪酯的MRM图；D：空白尿液中添加10 ng/mL依托咪酯酸的尿液MRM图。

Fig. 4 TIC and MRM chromatograms of urine samples

表3 尿液中添加依托咪酯和依托咪酯酸的线性范围、LOD和LOQ

Tab. 3 The linear range， LOD and LQD of etomidate and etomidate acid in urine

目标物	线性方程	线性范围/（ng·mL^-1）	相关系数（r）	LOD/（ng·mL^-1）	LOQ/（ng·mL^-1）
依托咪酯	y=8 144.8 x-2 669.4	0.5~50	0.995 0	0.2	0.5
依托咪酯酸	y=7 779 x+29 864	1~100	0.998 8	0.5	1

表4 尿液中添加依托咪酯和依托咪酯酸的基质效应、回收率及稳定性 (%)

Tab. 4 Matrix effect， recovery rate and stability of etomidate and etomidate acid in urine

目标物	质量浓度/（ng·mL^-1）	基质效应	回收率	冻融稳定性	长期稳定性
目标物	质量浓度/（ng·mL^-1）	基质效应	回收率	冻融稳定性	7 d	14 d	28 d
依托咪酯	0.5	18.47	96.64	110.23	103.51	110.65	91.26
	5	7.29	93.07	102.34	100.26	97.12	89.84
	50	5.42	84.25	98.49	99.55	97.24	90.75
依托咪酯酸	1	8.29	107.43	91.77	101.91	90.68	105.79
	10	7.11	110.26	102.31	96.36	93.80	92.16
	100	10.73	97.82	103.68	100.43	94.01	88.23

表5 尿液中添加依托咪酯和依托咪酯酸的准确度和精密度 (%)

Tab. 5 Accuracy and precision of etomidate and etomidate acid in urine

目标物	质量浓度/（ng·mL^-1）	准确度		精密度
目标物	质量浓度/（ng·mL^-1）	日内（n=6）	日间（n=18）	日内（n=6）	日间（n=18）
依托咪酯	0.5	110.80	109.53	9.35	1.61
	5	91.44	95.18	6.54	5.80
	50	100.14	100.96	5.13	1.16
依托咪酯酸	1	95.66	90.42	3.49	10.08
	10	98.72	107.24	3.28	9.77
	100	100.22	99.30	0.56	4.88

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