肿瘤不仅是我国，也是全世界的主要公共卫生问题，是我国最常见的死亡原因之一^[1-2]。肿瘤的发病率和死亡率居高不下，因肿瘤组织样本标记错误、混乱及污染等问题导致的医疗纠纷愈发频繁，涉及肿瘤组织溯源的司法鉴定案件也随之增加^[3-5]。但是，如何准确进行肿瘤组织的身源鉴定仍是法医学鉴定领域的难题，主要体现在以下两个方面：（1）肿瘤组织样本均为肿瘤细胞和正常细胞的混合样本，对于其较低组分的检出难度较大；（2）许多肿瘤在生长期间广泛存在STR水平的突变^[6-9]，这些突变导致无法用常规的个体识别判定标准来进行鉴定，这也是目前最主要的鉴定难点。虽然基于毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）平台的STR分型（CE-STR）技术已开发出许多成熟的体系用于普通检材的个体识别，但在肿瘤组织个体识别中的应用还比较缺乏。

2010年，有研究^[10-11]基于CE平台建立了肿瘤组织身源鉴定方法，但仅使用了15个STR基因座。随着检测技术的推陈出新，DNA联合索引系统（combined DNA index system，CODIS）在2011年更新为19个新的CODIS核心基因座，用于鉴定的STR基因座逐步多样化，既往模型已无法满足实际应用的需求。若使用更多的试剂盒来进行肿瘤组织身源鉴定，考虑到时间、成本、样本等问题，无法对多个试剂盒一一尝试。近年来，二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术不断发展和完善，其高通量、高灵敏度的特点^[12-13]使其能够容纳更多的遗传标记，无需多个体系联合使用就能得到足够多的STR分型结果，样本损耗小且成本逐渐降低，一次测序结果就可适配多个STR试剂盒，同时建立多个试剂盒的肿瘤组织身源鉴定模型，大大节省了样本和时间。此外，本课题组前期研究^[14]比较了肿瘤组织样本在NGS检测平台和CE检测平台的STR分型差异，结果表明两者的一致性高达91.43%。因此，基于NGS的STR检测技术 （NGS-STR）是为不同试剂盒建立肿瘤组织身源鉴定模型的有效工具。

本研究拟采用55例配对肿瘤组织样本的NGS-STR分型结果以及75例无关个体全血样本的NGS-STR分型检测数据，基于共有等位基因个数（number of total identical alleles，A_n ）和状态一致性（identity by state，IBS）评分为8个常用STR分型试剂盒建立肿瘤组织身源鉴定预测模型，并比较不同试剂盒之间的差异，以期为法医学鉴定工作中肿瘤组织的身源鉴定提供参考。

共使用78例配对肿瘤组织样本（肿瘤组织和同一个体正常组织成对），肿瘤样本均经病理学确认，来源于长海医院以及复旦大学附属华东医院，其中55例用于模型的建立，23例用于模型的准确性验证。75例无关个体全血样本为日常案件积累所得。所有研究对象在采样前均签署知情同意书，该研究已获得司法鉴定科学研究院伦理委员会的审批（审批文号：SJY2013-W002）。

将样本分为成对肿瘤（paired carcinoma，PC）、肿瘤-无关个体（tumor-unrelated individual，UI）、肿瘤-全同胞（tumor-simulated full sibling，FS）与肿瘤-亲子（tumor-simulated parent-offspring，PO）组。PC组为肿瘤组织和同一个体正常组织成对，共55对；UI组为肿瘤组织和无关个体血样成对，共4 125对；模拟55例肿瘤组织的全同胞和亲子分型数据，分别与对应的肿瘤组织形成FS组55对、PO组110对。分别统计各组的A_n 和IBS评分。

每例肿瘤组织取25 mg，使用DNeasy^® Blood & Tissue试剂盒（德国Qiagen公司）提取DNA，所有操作与步骤参考说明书进行。每例全血样本（无关个体）取200 μL，使用QIAamp^® DNA Blood Mini试剂盒（德国Qiagen公司）提取DNA，所有操作与步骤参考说明书进行。使用Qubit^TM dsDNA定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）检测DNA浓度。

使用ForenSeq^TM DNA Signature Prep试剂盒（美国Illumina公司）对样本进行测序，使用配套软件Universal Analysis Software（德国Qiagen公司）自动进行数据分析，操作步骤以及数据分析均按照相关使用说明执行。于本地服务器下载包含所测样本的基因座名称、基因分型、测序深度及序列信息的Excel文件，进行统计分析。

从法医学鉴定常用的STR分型试剂盒中筛选试剂盒用于后续模型的建立，筛选标准为：单一试剂盒所使用的STR基因座全部包含在ForenSeq^TM DNA Signature Prep试剂盒所检测到的27个STR基因座范围内。筛选出的8个试剂盒分别为：SiFaSTR^TM 23plex DNA身份鉴定系统（司法鉴定科学研究院研发，简称“SiFa-23plex”）^[15]、AGCU Expressmarker 22荧光检测试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司，简称“AGCU EX22”）^[16]、Goldeneye^® DNA身份鉴定系统20A［基点认知技术（北京）有限公司，简称“Goldeneye^® 20A”］^[17]、PowerPlex^® 21系统（美国Promega公司，简称“PowerPlex^® 21”）^[18]、AmpFℓSTR^TM Identifiler^TM PCR扩增试剂盒（美国Applied Biosystems公司，简称“AmpFℓSTR^TM Identifiler^TM”）^[19]、AmpFℓSTR^® Sinofiler^TM PCR扩增试剂盒（美国Applied Biosystems公司，简称“AmpFℓSTR^TM Sinofiler^TM”）^[19]、PowerPlex^® 16系统^[20]（美国Promega公司，简称“PowerPlex^® 16”）、AmpFℓSTR^TM NGM SElect^TM PCR扩增试剂盒（美国Applied Biosystems公司，简称“AmpFℓSTR^TM NGM”）^[21]，各试剂盒使用的STR基因座数量分别为21、21、19、20、15、15、15、15个，详见表1。

分别统计各试剂盒PC、UI、FS和PO组的A_n 与IBS评分情况。将每对样本在某一基因座上具有相同等位基因的个数记作A_n，根据其所拥有的共有等位基因个数，分为全不同基因座数量（A₀）、1个相同基因座数量（A₁）和2个相同基因座数量（A₂）。IBS评分为一对样本在每个基因座上所有相同等位基因数目的总和，即IBS=0×A₀+1×A₁+2×A₂。基于IBS评分系统构建肿瘤组织样本的身源鉴定预测模型，探究各试剂盒应用于肿瘤组织身源鉴定的差异。

使用55例配对肿瘤组织样本（肿瘤组织和同一个体正常组织成对）的NGS-STR检测结果，依据各试剂盒所使用的STR基因座，分别统计各试剂盒在PC、UI、FS和PO组的A_n 与IBS评分，取A_n 与IBS评分中区分能力最佳的指标作为训练组，为每一个试剂盒建立相应的肿瘤组织身源鉴定预测模型。

根据最佳指标在各组的表现，筛选出更适合作为肿瘤组织身源鉴定的STR基因座，并据此构建一个专用于肿瘤组织身源鉴定的模型。

使用另外23例配对肿瘤组织样本（肿瘤组织和同一个体正常组织成对）的NGS-STR检测结果对所有模型进行灵敏度验证；将23例肿瘤组织样本与75例无关个体全血样本的NGS-STR检测结果进行两两配对，形成1 725对非成对肿瘤组织对，对所有模型进行特异度验证；根据上述检测结果计算所有预测模型的准确度。对所有模型进行验证后，通过比较准确度、灵敏度和特异度探究各模型之间的差异。

应用GraphPad Prism 8.0软件（美国GraphPad Software公司）对数据进行分析，采用独立样本t检验比较各组间A_n 或IBS评分的差异，检验水准α=0.000 1。

统计各试剂盒不同组别A_n 和IBS评分的发生频率并进行拟合分析，探究各组样本的分布特点在各试剂盒中是否存在差异。

受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线的曲线下面积（area under the curve，AUC）可用于评估模型的准确性，AUC越大，表明其区分阳性和阴性的能力越强^[22]。将各试剂盒PC组的A_n 和IBS评分数据分别与UI、FS、PO 3组进行比较，并绘制ROC曲线计算AUC，根据AUC检测A_n 和IBS评分的区分能力，选择A_n 和IBS评分中区分能力最强的值作为确立肿瘤组织身源鉴定预测模型的阈值标准。

常用的诊断试验的数据资料有：真阳性（true positive，TP），即实际值和检测结果均为阳性；假阳性（false positive，FP），即实际值为阴性而检测结果为阳性；真阴性（true negative，TN），即实际值和检测结果均为阴性；假阴性（false negative，FN），即实际值为阳性而检测结果为阴性。根据上述数据计算模型的特异度、灵敏度和准确度。灵敏度表示真阳性率，即实际值为阳性时，检测结果也为阳性的研究对象在所有阳性对象中的比例，计算公式为：灵敏度=TP/（TP+FN）。特异度表示真阴性率，即实际值为阴性时，检测结果也为阴性的研究对象在所有阴性对象中的比例，计算公式为：特异度=TN/（FP+TN）。准确度，即实际值和检测结果均为阳性或阴性的结果在所有研究对象中的比例，计算公式为：准确度=（TP+TN）/（TP+TN+FP+FN）。约登指数可以直观展示模型的整体性能，约登指数越大提示准确度越佳，其计算公式为：约登指数=灵敏度+特异度-1^[22]。

统计各试剂盒分别使用A_n 和IBS评分区分PC组与另外3组（UI、FS、PO）时的灵敏度、特异度及约登指数，绘制ROC曲线得到最佳的阈值。此时，要求满足灵敏度和特异度均在95%以上、约登指数最大这两个条件，来保证模型的有效性。据此统计各试剂盒满足此条件的阈值及对应的灵敏度、特异度及约登指数，并将其作为各预测模型进行肿瘤组织身源鉴定的参考标准。

各试剂盒不同组别A_n 与IBS评分的统计结果显示，虽然各试剂盒不同组别A_n 和IBS评分的平均值各不相同，但是A₀、A₁、A₂以及IBS评分在PC、UI、FS、PO组中的分布规律一致（表2）。

各试剂盒PC组和PO组的A₀值极低，其中在PC组最高为0.15±0.26（AGCU EX22、SiFa-23plex），在PO组最高为0.35±0.52（SiFa-23plex），均小于1；A₀更多集中于UI组和FS组，以UI组为最，最高为8.03±1.73（PowerPlex^® 21）。各试剂盒的A₁值仍是在PC组最低，但在PO组最高，最高为15.05±1.62（SiFa-23plex），其次为FS组，之后为UI组。A₂在各组的分布与A₁相差较大，PC组中A₂值最高，FS组次之，UI组再次，PO组最低。

IBS评分结果显示，PC组最高，FS组和PO组次之，UI组最低。

所有试剂盒PC组的A₀值与UI、FS组相比，差异均有统计学意义（P<0.000 1），但与PO组相比，差异无统计学意义（P>0.000 1）。所有试剂盒PC组的A₁、A₂、IBS评分结果与其余3组相比，差异均有统计学意义（P<0.000 1）。

分别统计各试剂盒不同组别A_n 值和IBS评分的发生频率，得到拟合曲线（附图1）。A₀值在所有试剂盒中对于样本的区分度都是最低的，其在PC组的频率曲线与其他3组（UI、FS、PO组）均存在交叉，且与PO组的频率曲线几乎完全重合，表明仅依据A₀无法区分PC组和PO组的样本。从A₁、A₂和IBS评分的数据分布来看，PC组与其他3组的曲线虽有交叉，但是交叉面积较少，曲线分布相对独立，尤其在A₂和IBS评分条件下表现出来的区分度最佳。

本研究将8个试剂盒各自的PC组分别与UI、FS、PO组进行对比，绘制各试剂盒在A₀、A₂、A₁及IBS评分条件下的ROC曲线，并计算各自的AUC。结果（表3）显示：不同组别中A₀的AUC普遍较低，所有试剂盒在A₀条件下的AUC最低，尤其在PO组均低于0.6，说明在A₀条件下PC组与PO组之间差异无统计学意义（P>0.000 1）。各试剂盒在A₁和IBS评分条件下的AUC均不低于0.980 0，但在A₂条件下的AUC较A₁和IBS评分条件下更高，表明A₂的区分能力更强，除试剂盒AmpFℓSTR^TM Sinofiler^TM的UI组（AUC为0.998 7）和FS组（AUC为0.999 2）的AUC低于0.999 5外，其余试剂盒各组的AUC在A₂条件下均高于0.999 5且差异均有统计学意义（P<0.000 1）。因此，将A₂作为阈值设定的标准比A₀、A₁、IBS评分更为适合。

基于上述各试剂盒A_n 和IBS评分的统计结果，选择A₂作为确定肿瘤组织身源鉴定的标准阈值。据此，本研究得到8个试剂盒在不同的A₂阈值下对应的灵敏度与特异度（详见附表1~8）。对某一试剂盒来说，不同组别符合上述条件的A₂阈值范围存在一定差异。以SiFa-23plex试剂盒为例，当A₂≥11时，PC组与UI组即可区分，但PC组与FS、PO组则需分别在A₂≥13、A₂≥10时才可完全区分。若要在UI组满足灵敏度和特异度均达95%以上，A₂值应该在11~19；当A₂=13时，可得到最大约登指数为99.78，此时灵敏度为100%，特异度为99.78%，检测准确性最佳（附表8）。不仅如此，由于各试剂盒所用的基因座及基因座数量不同，不同试剂盒符合条件的A₂阈值标准范围也存在差异。本研究统计了各试剂盒区分PC组和UI、FS、PO组的阈值标准，详见表4。除试剂盒AmpFℓSTR^TM NGM区分PC组与UI组所需阈值（A₂≥10）较另两组高外，其他7个试剂盒用于区分PC组与FS组所需的A₂阈值是最高的。试剂盒所使用的STR基因座数量越多，区分PC组与其他各组的A₂阈值也越高，使用基因座数量多的试剂盒［AGCU EX22（21个）、PowerPlex^® 21（20个）、Goldeneye^® 20A（19个）、SiFa-23plex（21个）］完全区分各组的A₂阈值均为≥13；而使用基因座数量较少（15个）的试剂盒（AmpFℓSTR^TM Identifiler^TM、AmpFℓSTR^TM Sinofiler^TM、AmpFℓSTR^TM NGM、PowerPlex^® 16）完全区分各组的A₂阈值均更低，分别为≥10、≥11、≥9、≥10。

本研究统计了不同STR基因座在各组的A₂值（表5），得到在PC组A₂值最高的13个STR基因座（CSF1PO、D12S391、D19S433、D20S482、D2S1338、D3S1358、D4S2408、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA）以及在UI组A₂值最低的2个STR基因座（Penta E、D6S1043）共15个STR基因座来尝试构建肿瘤组织身源鉴定模型（15-STRs）。统计15-STRs模型共有等位基因的数量（A_n ）及IBS评分，结果见表6。PC组与其余3组的比较中，除了A₀值（0.07±0.13）与PO组（0.18±0.30）的差异无统计学意义外，其他A₀、A₁、A₂及IBS评分的差异均有统计学意义（P<0.000 1）。

经统计，若使用15-STRs模型进行肿瘤组织身源鉴定，可按照以下标准：A₂≥10时，可区分PC组与UI组；A₂≥12时，可区分PC组与FS组；A₂≥9时，可区分PC组与PO组。详见表7。

本研究对8个STR分型试剂盒构建的肿瘤组织身源鉴定预测模型以及15个STR基因座构建的肿瘤组织身源鉴定模型（15-STRs）进行了验证，得到的灵敏度、特异度和准确度详见表8。所有模型的灵敏度均达100%，特异度为97.56%~99.88%，准确度高达97.59%~99.89%。

其中，使用15-STRs模型对23例配对肿瘤组织样本进行灵敏度验证，结果显示每一对样本中的A₂均≥12，根据模型可完全区分PC组和UI、PO、FS 3组，即23对样本中的肿瘤组织和正常组织均来源于同一个体；对1 725对非成对肿瘤组织对进行检测，结果显示绝大多数非成对肿瘤组织对的A₂低于12，仅有2对（肿瘤组织58T和52T分别与1个无关个体正常组织配对形成的非成对肿瘤组织对）的A₂为12~13，根据模型可完全区分PC组和UI、PO、FS 3组，表明有2对非成对肿瘤组织对被误判为成对肿瘤组织对。经计算，15-STRs模型的准确度为99.89%，灵敏度为100%，特异度为99.88%，均高于另外8个STR分型试剂盒构建的肿瘤组织身源鉴定预测模型。

一直以来，肿瘤组织身源鉴定是法医学鉴定中的一个难点，由于肿瘤组织和正常组织混杂在一起，且肿瘤组织相较于正常组织出现基因突变的概率更高，极易出现等位基因丢失，导致分型结果出现误差。然而我国的肿瘤发病率一直居高不下，肿瘤组织的个体识别成为法医学鉴定领域迫切需要解决的一个问题。本研究所使用的肿瘤组织身源鉴定预测模型是基于27个STR基因座所建立的。在实际应用中，各试剂盒所用的STR基因座、数量都不同，因此无法完全按照之前建立的标准^[14]来进行肿瘤组织身源鉴定。为此本研究筛选了8个常用STR分型试剂盒，为各试剂盒建立了基于A_n 和IBS评分系统的肿瘤组织身源鉴定预测模型，据此来比较应用不同试剂盒进行肿瘤组织个体识别的差异，同时也为之后应用各试剂盒进行肿瘤组织个体识别提供参考。肿瘤组织与正常组织相比，存在较高的微卫星不稳定性和较多的杂合性丢失现象^[7]。与CE平台相比，NGS检测平台检测深度高，能够同时检测的遗传标记更多，可以更好地区分等位基因^[12]，因此更适合用于肿瘤组织的检测。ForenSeq^TM DNA Signature Prep试剂盒作为法医学领域常用的NGS试剂盒，也是发展最成熟的试剂盒之一，无疑是首选试剂盒。在本研究中，使用该试剂盒对55例配对肿瘤组织和75例无关个体正常组织样本进行了27个常染色体STR分型，根据8个常用STR分型试剂盒所使用的STR基因座，挑选出对应的STR分型数据，分为PC、UI、FS和PO组，并根据各组A_n 和IBS评分的统计结果建立相应的预测模型，为各试剂盒的肿瘤组织身源鉴定提供相应的参考标准，以期更加便捷地进行肿瘤组织身源鉴定。由于各试剂盒使用的STR基因座不同，参考标准也有差异，在实际应用中，可以根据所使用的试剂盒选择相应的标准来进行肿瘤组织身源鉴定。

此外，本研究尝试组建一个新的专门用于肿瘤组织身源鉴定的模型，根据本课题组前期构建的肿瘤组织身源鉴定方法^[14]，表明A₂最适合作为构建模型的主要参考。同时，基于上述对8个STR分型试剂盒A_n 值和IBS评分的分析，表明A₂作为阈值设定的标准比A₀、A₁、IBS评分更为适合。据此，本研究参考A₂值筛选出更适合作为肿瘤组织身源鉴定的STR基因座。STR基因座的A₂值在PC组越高，能够检测到的目标等位基因越多，具有越高的灵敏度；在UI、FS、PO组越低，说明其在不同个体相似的等位基因越少，具有越高的特异度。本研究对比的8个试剂盒使用的基因座数量在15~21个，其中AGCU EX22、Goldeneye^® 20A、PowerPlex^® 21、SiFa-23plex使用的STR基因座数量均≥19个，确定所检测的肿瘤组织与正常组织源于同一个体只需要A₂≥13即可（各试剂盒特异度和灵敏度均在95%以上），故本研究仅筛选了15个STR基因座来构建肿瘤组织身源鉴定模型（15-STRs），并确定了相应的鉴定标准。基于数据分析结果，应用15-STRs模型进行肿瘤组织身源鉴定的标准为：（1）如果A₂≥10，则表明所检测肿瘤组织与正常组织不是来源于无关个体；（2）如果A₂≥12，则可确定所检测的肿瘤组织与正常组织源于同一个体。本研究使用另外23例配对肿瘤组织样本对模型进行验证，准确度高达99.89%，特异度也达到了99.88%。本研究所建立的15-STRs模型的准确度和特异度比8个常用STR分型试剂盒都高，说明其更适用于肿瘤组织的身源鉴定。

肿瘤组织并不作为司法鉴定首选的检材来使用，因此，长时间以来肿瘤组织的身源鉴定在法医学鉴定领域存在一定的欠缺，本课题组既往建立的肿瘤组织鉴定模型^[14]在一定程度上弥补了基于NGS的肿瘤组织身源识别方法，但在实际应用方面仍有许多问题值得探索。本研究构建的肿瘤组织身源鉴定预测模型为8个常用STR分型试剂盒用于肿瘤组织身源鉴定提供了相应的参考，在实际案件的应用中也更加快捷方便。同时本研究对构建专门的肿瘤组织鉴定试剂盒进行了探索，选取了15个适合用于肿瘤组织身源鉴定的STR基因座，并提供了鉴定标准，为今后构建相应的体系提供了数据基础。

本研究受限于样本数量，并未对肿瘤组织的类型进行细分，不同类型的肿瘤其鉴定结果可能存在差异，因此，对于肿瘤组织的身源鉴定仍需要进一步的探索和研究。