束缚应激致高脂血症ApoE-/-小鼠心肌损伤的分子靶标筛选与机制分析

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2023.430808

摘要/Abstract

摘要：

目的采用蛋白质组学技术筛选慢性束缚应激致高脂血症小鼠心肌损伤的标志物及其潜在机制。方法通过束缚ApoE^-/-小鼠建立高脂血症合并慢性应激模型，运用蛋白质组学与生物信息学等技术描绘慢性应激对高脂血症小鼠心肌损伤的特征性分子改变及相关调控机制，并从中探索潜在的诊断标志物。结果蛋白质组学分析结果显示，与高脂血症组相比，高脂血症合并束缚应激组小鼠共有43个显著上调与58个显著下调的差异表达蛋白质。其中，GBP2、TAOK3、TFR1、UCP1是极具诊断潜力的分子标志物。KEGG通路富集分析结果表明，铁死亡是加剧高脂血症合并束缚应激模型心肌损伤的重要机制通路。mmu_circ_0001567/miR-7a/Tfr-1和mmu_circ_0001042/miR-7a/Tfr-1可能是该模型中与铁死亡相关的重要circRNA-miRNA-mRNA调控网络。结论慢性束缚应激可能通过铁死亡加剧高脂血症小鼠的心肌损伤，本研究筛选出4个具有潜在应用价值的心肌损伤分子诊断标志物，为高脂血症合并应激致心脏性猝死的研究提供了新的方向。

关键词: 法医病理学, 生物信息学, 慢性束缚应激, 高脂血症, 铁死亡, 生物标志物, 心肌损伤, 小鼠

Abstract:

Objective To explore the biomarkers and potential mechanisms of chronic restraint stress-induced myocardial injury in hyperlipidemia ApoE^-/- mice. Methods The hyperlipidemia combined with the chronic stress model was established by restraining the ApoE^-/- mice. Proteomics and bioinformatics techniques were used to describe the characteristic molecular changes and related regulatory mechanisms of chronic stress-induced myocardial injury in hyperlipidemia mice and to explore potential diagnostic biomarkers. Results Proteomic analysis showed that there were 43 significantly up-regulated and 58 significantly down-regulated differentially expressed proteins in hyperlipidemia combined with the restraint stress group compared with the hyperlipidemia group. Among them, GBP2, TAOK3, TFR1 and UCP1 were biomarkers with great diagnostic potential. KEGG pathway enrichment analysis indicated that ferroptosis was a significant pathway that accelerated the myocardial injury in hyperlipidemia combined with restraint stress-induced model. The mmu_circ_0001567/miR-7a/Tfr-1 and mmu_circ_0001042/miR-7a/Tfr-1 might be important circRNA-miRNA-mRNA regulatory networks related to ferroptosis in this model. Conclusion Chronic restraint stress may aggravate myocardial injury in hyperlipidemia mice via ferroptosis. Four potential biomarkers are selected for myocardial injury diagnosis, providing a new direction for sudden cardiac death （SCD） caused by hyperlipidemia combined with the restraint stress.

Key words: forensic pathology, bioinformatics, chronic restraint stress, hyperlipidemia, ferroptosis, biomarker, myocardial injury, mice

中图分类号:

陈尚亨, 董盛仲, 王智敏, 洪光辉, 叶星, 林子杰, 林俊毅, 江洁清, 王守宇, 林汉成, 沈忆文. 束缚应激致高脂血症ApoE^-/-小鼠心肌损伤的分子靶标筛选与机制分析[J]. 法医学杂志, 2024, 40(2): 172-178.

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图/表 12

表1 目的基因与内参基因的引物序列

Tab. 1 Primer sequences of the target genesand reference gene

基因	引物序列（5′→3′）
Tfr-1	F：GTTTCTGCCAGCCCCTTATTAT
Tfr-1	R：GCAAGGAAAGGATATGCAGCA
Slc7a11	F：CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC
Slc7a11	R：CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT
β-actin	F：GTGACGTTGACATCCGTAAAGA
β-actin	R：GCCGGACTCATCGTACTCC
mmu_circ_0001567	F：TCCTGTGGAAAAGGTGGATGTT
mmu_circ_0001567	R：CAGATGCGCTTTCACTGAGTC
mmu_circ_0001042	F：CAGGGTCAGAAGGATCGTCG
mmu_circ_0001042	R：GAGCGAGTCAGACAACTGCT
miR-7a	F：GCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGT
miR-7a	R：通用反向引物

图1 AP组和APR组小鼠的心电图及心脏M型超声影像A：特征心电图；B：特征心脏M型超声影像。

Fig. 1 Electrocardiograms and M-mode echocardiographyimages of mice in the AP and APR groups

表2 AP组和APR组小鼠的心率、EF和FS (n=6，x¯±s)

Tab. 2 The heart rate， EF and FS ofmice in the AP and APR groups

组别	心率/（次·min^-1）	FS/%	EF/%
AP	448.50±39.09	33.18±2.27	71.56±2.49
APR	373.00±22.77^1）	28.05±2.05^1）	62.25±3.73^1）

表3 AP组和APR组小鼠血清中皮质酮、BNP、CK和MDA的浓度 (n=3，x¯±s)

Tab. 3 The concentrations of corticosterone， BNP， CK and MDA in the serum of mice in the AP and APR groups

组别	皮质酮/（ng·mL^-1）	BNP/（pg·mL^-1）	CK/（U·mL^-1）	MDA/（ng·mL^-1）
AP	77.57±21.12	1 086.00±204.80	1.34±0.14	2.53±0.53
APR	158.90±40.45^1）	3 098.00±487.50^1）	1.70±0.15^1）	4.66±0.30^1）

图2 AP组与APR组小鼠心肌组织差异表达蛋白火山图

Fig. 2 Volcano plot of differentially expressed proteins inthe myocardium of mice between the AP and APR groups

表4 AP组和APR组小鼠心肌组织差异表达蛋白的相对表达量 (n=3，x¯±s)

Tab. 4 Relative expression levels of differentiallyexpressed proteins in the myocardium of micebetween the AP and APR groups

组别	GBP2	TAOK3	UCP1	TFR1
AP	1.45±0.17	0.85±0.07	0.10±0.04	0.37±0.01
APR	0.49±0.08^1）	0.38±0.10^1）	0.92±0.29^1）	0.56±0.04^1）

图3 AP组与APR组小鼠心肌组织的差异表达蛋白（蛋白质印迹法）

Fig. 3 Differentially expressed proteins in the myocardium ofmice between the AP and APR groups （Western blotting）

图4 AP组和APR组小鼠心肌组织差异表达蛋白的前20条KEGG通路富集气泡图

Fig. 4 Bubble chart of the top 20 enriched KEGG pathways of differentially expressed proteinsin the myocardium of mice between the AP and APR groups

图5 AP组和APR组小鼠心肌组织TFR1的免疫组织化学染色结果A：AP组；B：APR组。

Fig. 5 Immunohistochemical staining results of TFR1 in the myocardium of mice in the AP and APR groups

表5 AP组和APR组小鼠心肌组织中铁死亡相关基因mRNA和蛋白质的相对表达量 (n=3，x¯±s)

Tab. 5 Relative expression levels of mRNA and proteinof ferroptosis-related genes in the myocardiumof mice in the AP and APR groups

组别	Tfr-1		Slc7a11
组别	mRNA	蛋白质	mRNA	蛋白质
AP	0.97±0.13	0.37±0.01	1.00±0.02	0.52±0.07
APR	6.67±0.30^1）	0.56±0.04^1）	0.25±0.08^1）	0.38±0.04^1）

表6 AP组和APR组小鼠心肌组织中miR-7a和与其有相互作用的circRNA的相对表达量 (n=3，x¯±s)

Tab. 6 Relative expression levels of miR-7a and circRNAsthat interact with miR-7a in the myocardiumof mice in the AP and APR groups

组别	miR-7a	mmu_circ_0001567	mmu_circ_0001042
AP	1.01±0.16	1.03±0.31	1.01±0.18
APR	0.46±0.06^1）	6.04±1.38^1）	4.36±1.12^1）

图6 circRNA、miRNA和Tfr-1 mRNA相互作用预测结果

Fig. 6 The predicted results of the interaction amongcircRNA， miRNA and Tfr-1 mRNA

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