束缚应激致高脂血症ApoE-/-小鼠心肌损伤的分子靶标筛选与机制分析

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2023.430808

摘要/Abstract

摘要：

目的采用蛋白质组学技术筛选慢性应激致高脂血症小鼠心肌损伤的标志物及其潜在机制。方法通过束缚ApoE^-/-小鼠建立高脂血症合并慢性应激模型，运用蛋白质组学与生物信息学等技术描绘慢性应激对高脂血症小鼠心肌损伤的特征性分子改变及相关调控机制，并从中探索潜在的诊断标志物。结果蛋白质组学分析结果显示，与高脂血症组相比，高脂血症合并束缚应激组小鼠共有43个显著上调与58个显著下调的差异表达蛋白质。其中，GBP2、TAOK3、TFR1、UCP1是极具诊断潜力的分子标志物。KEGG富集分析结果表明，铁死亡是加剧高脂血症合并束缚应激模型心肌损伤的重要机制通路，分析认为并预测mmu_circ_0001567/miR-7a/Tfr-1和mmu_circ_0001042/miR-7a/Tfr-1可能是该模型中与铁死亡相关的重要circRNA-miRNA-mRNA调控网络。结论慢性应激可能通过铁死亡加剧高脂血症小鼠的心肌损伤，筛选出4个具有潜在应用价值的心肌损伤分子诊断标志物，为应激合并高脂血症致心脏性猝死的研究提供了新的方向。

关键词: 法医病理学, 生物信息学, 慢性束缚应激, 高脂血症, 铁死亡, 生物标志物, 心肌损伤, 小鼠

Abstract:

Objective To explore the biomarkers and potential mechanisms of chronic stress-induced myocardial injury in ApoE^-/- mice. Methods The hyperlipidemia combined with the chronic stress model was established by restraining the ApoE^-/- mice. Proteomics and bioinformatics techniques were used to describe the characteristic molecular changes and related regulatory mechanisms of chronic stress-induced myocardial injury in hyperlipidemia mice and to explore potential diagnostic biomarkers. Results Proteomic analysis showed that there were 43 significantly up-regulated and 58 significantly down-regulated differentially expressed proteins in hyperlipidemia combined with the restrain stress group compared with the hyperlipidemia group. Among them, GBP2, TAOK3, TFR1 and UCP1 were biomarkers with great diagnostic potential. KEGG enrichment analysis indicated that ferroptosis was a significant pathway that aggravated stress-induced myocardial injury in ApoE^-/- mice. The analysis suggested and predicted that mmu_circ_0001567/miR-7a/Tfr-1 and mmu_circ_0001042/miR-7a/Tfr-1 might be important circRNA-miRNA-mRNA regulatory networks in ferroptosis. Conclusion Chronic stress may aggravate myocardial injury in ApoE^-/- mice via ferroptosis. Four potential biomarkers are selected for myocardial injury diagnosis, providing a new direction for SCD caused by stress combined with hyperlipidemia.

Key words: forensic pathology, bioinformatics, chronic restraint stress, hyperlipidemia, ferroptosis, biomarker, myocardial injury, mice

中图分类号:

陈尚亨, 董盛仲, 王智敏, 洪光辉, 叶星, 林子杰, 林俊毅, 江洁清, 王守宇, 林汉成, 沈忆文. 束缚应激致高脂血症ApoE^-/-小鼠心肌损伤的分子靶标筛选与机制分析[J]. 法医学杂志, DOI: 10.12116/j.issn.1004-5619.2023.430808.

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图/表 12

表1 目的基因与内参基因的引物序列

Tab. 1 Primers for target gene and housekeeping gene

基因	引物序列（5′→3′）
Tfr-1	F：GTTTCTGCCAGCCCCTTATTAT
Tfr-1	R：GCAAGGAAAGGATATGCAGCA
Slc7a11	F：CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC
Slc7a11	R：CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT
β-actin	F：GTGACGTTGACATCCGTAAAGA
β-actin	R：GCCGGACTCATCGTACTCC
mmu_circ_0001567	F：TCCTGTGGAAAAGGTGGATGTT
mmu_circ_0001567	R：CAGATGCGCTTTCACTGAGTC
mmu_circ_0001042	F：CAGGGTCAGAAGGATCGTCG
mmu_circ_0001042	R：GAGCGAGTCAGACAACTGCT
miR-7a	F：GCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGT
miR-7a	R：通用反向引物

图1 AP组和APR组小鼠心电图及心脏M型超声图A：特征心电图；B：特征心脏M型超声图。

Fig. 1 Electrocardiogram M-mode echogram of mice heart

表2 AP组和APR组小鼠的心率、EF和FS (n=6，x¯±s)

Tab. 2 Heart Rate， EF and FS in mice

组别	心率/（次·min^-1）	FS/%	EF/%
AP	448.50±39.09	33.18±2.27	71.56±2.49
APR	373.00±22.77^1）	28.05±2.05^1）	62.25±3.73^1）

表3 AP组和APR组小鼠血清皮质酮、BNP、CK和MDA的浓度 (n=3，x¯±s)

Tab. 3 The concentrations of serum corticosterone， BNP，CK and MDA in mice

组别	皮质酮/（ng·mL^-1）	BNP/（pg·mL^-1）	CK/（U·mL^-1）	MDA/（ng·mL^-1）
AP	77.57±21.12	1 086.00±204.80	1.34±0.14	2.53±0.53
APR	158.90±40.45^1）	3 098.00±487.50^1）	1.70±0.15^1）	4.66±0.30^1）

图2 AP组与APR组小鼠心脏蛋白组学差异表达蛋白火山图

Fig. 2 The volcano plot of differentially expressed proteinin mice myocardium between AP and APR

图3 蛋白质印迹法检测小鼠心肌组织差异表达蛋白

Fig. 3 Western blotting for differentially expressedproteins in mice myocardium

表4 AP组和APR组小鼠心肌组织差异表达蛋白的相对表达量 (n=3，x¯±s)

Tab. 4 Relative expression of mice myocardiumproteins detected by Western blotting

组别	GBP2	TAOK3	UCP1	TFR1
AP	1.45±0.17	0.85±0.07	0.10±0.04	0.37±0.01
APR	0.49±0.08^1）	0.38±0.10^1）	0.92±0.29^1）	0.56±0.04^1）

图4 KEGG富集气泡图

Fig. 4 Bubble map of KEGG enrichment analysis

图5 AP组和APR组小鼠的心肌TFR1免疫组织化学染色结果A：AP组；B：APR组。

Fig. 5 Representative photomicrograph of TFR1 protein levels detected by IHC staining

表5 AP组和APR组小鼠心肌组织中铁死亡相关基因mRNA和蛋白质的相对表达量 (n=3，x¯±s)

Tab. 5 Relative expression of ferroptosis-relatedgenes in mice myocardium by RT-qPCR

组别	Tfr-1		Slc7a11
组别	mRNA	蛋白质	mRNA	蛋白质
AP	0.97±0.13	0.37±0.01	1.00±0.02	0.52±0.07
APR	6.67±0.30^1）	0.56±0.04^1）	0.25±0.08^1）	0.38±0.04^1）

表6 AP组和APR组小鼠心肌组织中miR-7a和与其有相互作用的circRNA的相对表达量 (n=3，x¯±s)

Tab.6 Relative expression of circRNAs interacting withmiR-7a and miR-7a detected by RT-qPCR

组别	miR-7a	mmu_circ_0001567	mmu_circ_0001042
AP	1.01±0.16	1.03±0.31	1.01±0.18
APR	0.46±0.06^1）	6.04±1.38^1）	4.36±1.12^1）

图6 circRNA、miRNA和Tfr-1分子预测到的结合位

Fig.6 Predicted binding sites of CircRNA，miRNA and Tfr-1 mRNA

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