应用UPLC-QTOF-MS分析滇乌头碱中毒大鼠尿液非靶向代谢组学

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2020.301003

法医学杂志 ›› 2021, Vol. 37 ›› Issue (5): 653-660.DOI: 10.12116/j.issn.1004-5619.2020.301003

应用UPLC-QTOF-MS分析滇乌头碱中毒大鼠尿液非靶向代谢组学

周惠黠¹(), 刘欢², 韩雪¹, 聂胜洁¹, 张荣平³^,⁴, 于建云¹(), 李树华¹()

^1.昆明医科大学法医学院，云南昆明 650500
^2.昆明医科大学司法鉴定中心，云南昆明 650500
^3.昆明医科大学药学院，云南昆明 650500
^4.云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500

收稿日期:2020-10-27 发布日期:2021-10-25 出版日期:2021-10-28
通讯作者: 于建云,李树华
作者简介:于建云，男，教授，从事法医病理与毒理学研究；E-mail：jianyunyu@sina.com
李树华，女，高级实验师，主要从事法医毒物学研究；E-mail：2530428326@qq.com
周惠黠（1996—），女，硕士研究生，主要从事法医病理与毒理学研究；E-mail：764267288@qq.com
基金资助:
云南省创新团队资助项目(202005AE160004);国家重点研发计划资助项目(2018YFC0807201-4)

Application of UPLC-QTOF-MS in Analysis of Non-targeted Urine Metabolomics in Rats with Yunaconitine Poisoning

Hui-xia ZHOU¹(), Huan LIU², Xue HAN¹, Sheng-jie NIE¹, Rong-ping ZHANG³^,⁴, Jian-yun YU¹(), Shu-hua LI¹()

^1.School of Forensic Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, China
^2.Judicial Expertise Center, Kunming Medical University, Kunming 650500, China
^3.School of Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, China
^4.School of Traditional Chinese Pharmacy, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China

Received:2020-10-27 Online:2021-10-25 Published:2021-10-28
Contact: Jian-yun YU,Shu-hua LI

摘要/Abstract

摘要： 目的

通过非靶向代谢组学研究滇乌头碱慢性中毒大鼠尿液代谢谱的变化，探讨滇乌头碱中毒的可能机制。

方法

建立滇乌头碱大鼠中毒模型，采用基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）技术的代谢组学方法，获得尿液代谢轮廓，应用主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA），依据变量投影重要度（variable importance in projection，VIP）>1、变化倍数（fold change，FC）>3或<0.33、P<0.05筛选出与滇乌头碱毒性相关的潜在生物学标志物，通过MetaboAnalyst网站进行代谢通路分析，同时观察相关组织的病理学改变。

结果

筛选出L-异亮氨酸等16个潜在生物学标志物，主要涉及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的生物合成、降解，戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化，丙酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，酪氨酸代谢等6条代谢通路。病理学研究可见滇乌头碱导致的大鼠神经系统、肝和心脏毒性病变。

结论

滇乌头碱可能通过影响氨基酸和糖代谢，产生神经系统、肝和心脏等毒性。

关键词: 法医毒理学, 代谢组学, 中毒, 滇乌头碱, 超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱, 尿液, 大鼠

Abstract: Objective

To explore the possible mechanism of Yunaconitine poisoning by studying the changes of urine metabolic profile in rats chronically poisoned by Yunaconitine via non-targeted metabolomics.

Methods

A rat model of Yunaconitine poisoning was established, and a metabolomics method based on UPLC-QTOF-MS technology was used to obtain the urine metabolic profile. Principal component analysis （PCA）, orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis （OPLS-DA）, variable importance in projection （VIP） value greater than 1, fold change （FC） value greater than 3 or less than 0.33 and P value less than 0.05 were used to screen potential biomarkers related to the toxicity of Yunaconitine. The metabolic pathway analysis was performed through the MetaboAnalyst website and pathological changes of related tissues were observed.

Results

Sixteen potential biomarkers including L-isoleucine were screened, which mainly involved six metabolic pathways including the biosynthesis and degradation of valine, leucine and isoleucine, pentose and glucuronate interconversions, and propanoate metabolism, alanine, aspartate and glutamate metabolism, tyrosine metabolism. Pathological studies showed that rat toxic change in nervous system, liver and cardiac caused by Yunaconitine.

Conclusion

Yunaconitine may cause neurotoxicity, hepatotoxicity and cardiotoxicity by affecting amino acid and glucose metabolism.

Key words: forensic toxicology, metabolomics, poisoning, Yunaconitine, ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight-mass spectrometry, urine, rats

中图分类号:

DF795.1

周惠黠, 刘欢, 韩雪, 聂胜洁, 张荣平, 于建云, 李树华. 应用UPLC-QTOF-MS分析滇乌头碱中毒大鼠尿液非靶向代谢组学[J]. 法医学杂志, 2021, 37(5): 653-660.

Hui-xia ZHOU, Huan LIU, Xue HAN, Sheng-jie NIE, Rong-ping ZHANG, Jian-yun YU, Shu-hua LI. Application of UPLC-QTOF-MS in Analysis of Non-targeted Urine Metabolomics in Rats with Yunaconitine Poisoning[J]. Journal of Forensic Medicine, 2021, 37(5): 653-660.

图/表 8

图1 各组大鼠肝组织病理学检验（HE×400）A：橄榄油组；B：滇乌头碱+橄榄油组；C：稀盐酸溶液组；D：滇乌头碱+稀盐酸溶液组。

Fig. 1 Histopathological examination of rats hepatic tissue in each group （HE×400）

图2 各组大鼠心肌组织病理学检验（HE×400）A：橄榄油组；B：滇乌头碱+橄榄油组；C：稀盐酸溶液组；D：滇乌头碱+稀盐酸溶液组。

Fig. 2 Histopathological examination of rats myocardium in each group （HE×400）

图3 各组大鼠脑组织病理学检验（Nissl×400）A：橄榄油组皮质脑区；B：滇乌头碱+橄榄油组皮质脑区；C：稀盐酸溶液组皮质脑区；D：滇乌头碱+稀盐酸溶液组皮质脑区；E：橄榄油组海马脑区；F：滇乌头碱+橄榄油组海马脑区；G：稀盐酸溶液组海马脑区；H：滇乌头碱+稀盐酸溶液组海马脑区。

Fig. 3 Histopathological examination of rats brain tissue in each group （Nissl×400）

图4 全部样本的PCA得分散点图A：ESI+；B：ESI-。

Fig. 4 PCA score scatter plot of total samples

图5 橄榄油组和滇乌头碱+橄榄油组的火山图A：ESI+；B：ESI-。红色表示显著上调的代谢物，蓝色表示显著下调的代谢物，灰色表示非显著性差异的代谢。

Fig. 5 Volcano plot for olive oil group against Yunaconitine plus olive oil group

图6 稀盐酸溶液组和滇乌头碱+稀盐酸溶液组的火山图A：ESI+；B：ESI-。红色表示显著上调的代谢物，蓝色表示显著下调的代谢物，灰色表示非显著性差异的代谢。

Fig. 6 Volcano plot for dilute hydrochloric acid solution group against Yunaconitine plus dilute hydrochloric acid solution

表1 滇乌头碱中毒相关潜在生物学标志物信息

Tab. 1 Information on potential biomarkers related to intoxication of Yunaconitine

序号	生物学标志物	相对分子质量	分子式	FC_橄榄油	FC_稀盐酸
1	L-异亮氨酸	131.09	C₆H₁₃NO₂	5.15	11.82
2	羟基异己二酸	132.08	C₆H₁₂O₃	11.69	18.19
3	甲基丙二酸	118.03	C₄H₆O₄	3.48	5.63
4	腺苷琥珀酸	463.07	C₁₄H₁₈N₅O₁₁P	4.34	3.30
5	N-乙酰基-D-苯丙氨酸	207.23	C₁₁H₁₃NO₃	4.01	3.42
6	3-甲氧基酪胺	167.09	C₉H₁₃NO₂	4.94	3.54
7	D-木糖	150.05	C₅H₁₀O₅	3.08	4.08
8	2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸酯	278.09	C₅H₁₂O₉P₂	0.29	0.33
9	6-磷酸-D-山梨醇	262.15	C₆H₁₅O₉P	0.18	0.28
10	酵母氨酸	276.29	C₁₁H₂₀N₂O₆	8.23	7.40
11	丙酸	70.01	C₃H₂O₂	3.51	3.10
12	尿囊素	158.04	C₄H₆N₄O₃	8.94	18.90
13	N-乙酰基-DL-甲硫氨酸	191.25	C₇H₁₃NO₃S	3.37	6.22
14	4-硝基喹啉-1-氧化物	190.16	C₉H₆N₂O₃	3.58	6.03
15	二氢硫辛酸酯	208.06	C₈H₁₆O₂S₂	9.31	3.55
16	硫酸吲哚酚	213.01	C₈H₇NO₄S	5.63	4.50

图7 代谢通路分析（气泡图）

Fig. 7 Metabolic pathway analysis （bubble chart）

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