鉴别6种常见食用肉类的多重PCR检测体系的构建及验证

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2023.531002

摘要/Abstract

摘要：

目的建立一种快速、准确、灵敏的多重PCR检测方法，用于同时鉴别6种常见食用肉类（牛、羊、鸡、猪、鹅、鸭），并评估其在肉类食品掺假鉴定中的应用价值。方法基于GenBank数据库中6个物种的线粒体全基因组序列，筛选具有种内保守性、种间特异性的DNA序列（牛16S rRNA、羊COX-1、鸡Cytb、猪COX-1、鹅NADH2、鸭16S rRNA），并设计物种特异性引物，以此构建一个可同时鉴别6种常见食用肉类的多重PCR检测体系。对该体系进行种属特异性、灵敏度和重复性研究，并进行模拟混合样品检测。结果成功构建了一个可同时鉴别6种常见食用肉类的多重PCR检测体系，该体系在非目标物种的DNA中均未有效扩增；在DNA模板量为0.062 5~2 ng/μL时，6个物种的扩增产物均能检见。在鸭肉和牛肉混合比例低至0.5%时，仍能检测到鸭肉成分。结论本研究构建了一个特异性强、灵敏度高、重复性好的多重PCR检测体系，可准确鉴别6种常见食用肉类食品中的动物源性成分，为我国常见食用肉类及肉制品的掺假鉴定提供了一种简单、实用的检测技术。

关键词: 法医物证学, 线粒体DNA, 多重PCR, 种属鉴定, 食用肉类

Abstract:

Objective To establish a rapid， accurate， and sensitive multiplex PCR detection method for the simultaneous identification of the six common edible meats （beef， lamp， chicken， pork， goose， duck）， and to evaluate its application value in meat adulteration identification. Methods Based on complete mitochondrial genomic sequences of six species in the GenBank database， DNA sequences （cattle： 16S rRNA; sheep： COX-1; chickens： Cytb; pig： COX-1; goose： NADH2; duck： 16S rRNA） with intra-species conservation and inter-species specificity were screened， and species-specific primers were designed to construct a multiplex PCR detection system that can simultaneously detect the meat of six common species. The species specificity， sensitivity and reproducibility of the system were studied, and the simulated mixture sample detection was performed. Results This study successfully constructed a multiplex PCR detection system that can detect the meats of six common species simultaneously. The system was not effective in DNA amplification of non-target species. When the DNA template sizes were 0.062 5-2 ng/μL， the amplified products of all six species could be detected. The duck component was still detected when the mixing ratio of duck and beef was as low as 0.5%. Conclusion This study constructs and establishes a multiplex PCR detection system with strong specificity， high sensitivity， and good reproducibility. It can accurately identify the components of animal origin in common edible meats and provide a simple and practical method for identifying adulteration of common edible meats and meat products in China.

Key words: forensic genetics, mitochondrial DNA, multiplex PCR, species identification, edible meat

中图分类号:

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图/表 4

表1 6种常见食用肉类物种的特异性引物信息

Tab. 1 Information on specific primers for six common edible meat species

物种	目标基因	引物序列（5´→3´）	扩增长度/bp	引物浓度/（μmol·L^-1）
牛	16S rRNA	正向：ACACAGGAGTGCATCTAAGG	104	0.40
牛	16S rRNA	反向：AATACTGGGAATGCTGGAGG	104	0.40
羊	COX-1^[28]	正向：CACGACGATACTCTGATTAC	157	0.40
	COX-1^[28]	反向：GTGGTTAGGTCTACAGTTAG	157	0.40
鸡	Cytb	正向：ACACTTGCCGGAACGTACAA	205	0.16
鸡	Cytb	反向：CCCCATGGGAGAACATAGCC	205	0.16
猪	COX-1^[28]	正向：CGGGTACACACTCAACCAAG	268	0.16
猪	COX-1^[28]	反向：TGTGCTTGTCAGTTCTACTGC	268	0.16
鹅	NADH2	正向：TGCTACTCTCGACCCTCAT	313	0.32
鹅	NADH2	反向：GTTGTGATCATGGATAGGTTAAGG	313	0.32
鸭	16S rRNA	正向：CTAGCTCAGCCGCTTAAACA	495	0.56
鸭	16S rRNA	反向：TCCACTAGTCGAGGTTGTGT	495	0.56

图1 多重PCR扩增和种属特异性检测结果M：100 bp DNA分子量标准品；1：牛、羊、鸡、猪、鹅和鸭的DNA混合物；2：牛；3：羊；4：鸡；5：猪；6：鹅；7：鸭；8：驴；9：狗；10：兔；11：马；12：鼠；13：猫；14：人；15：空白对照。

Fig. 1 Detection results of multiplex PCR amplification and species specificity

图2 多重PCR检测体系灵敏度检测结果A：牛；B：羊；C：鸡；D：猪；E：鹅；F：鸭。M：100 bp DNA分子量标准品；1：牛、羊、鸡、猪、鹅和鸭的DNA混合物；2：质量浓度为2 ng/μL；3：质量浓度为1 ng/μL；4：质量浓度为0.5 ng/μL；5：质量浓度为0.25 ng/μL；6：质量浓度为0.125 ng/μL；7：质量浓度为0.062 5 ng/μL；8：空白对照。

Fig. 2 Sensitivity detection results of multiplex PCR detection system

图3 模拟鸭肉掺假牛肉样本的检测结果M：100 bp DNA分子量标准品；1：牛、羊、鸡、猪、鹅和鸭的DNA混合物；2：添加鸭肉与牛肉的质量比为10%；3：添加鸭肉与牛肉的质量比为5%；4：添加鸭肉与牛肉的质量比为1%；5：添加鸭肉与牛肉的质量比为0.5%；6：空白对照。

Fig. 3 Detection results of the simulated samplesof duck mixed with beef

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