国产人类DNA定量试剂盒的验证及法医学应用

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2023.531101

摘要/Abstract

摘要：

目的验证一款基于实时荧光定量PCR的国产人类DNA定量试剂盒在检测人类DNA总浓度、男女性混合样品中男性DNA浓度、DNA降解程度和含抑制剂情况等方面的效能。方法将不同DNA浓度、不同男女性混合比例、不同抑制剂浓度和不同降解程度的样品使用一款基于实时荧光定量PCR的国产人类DNA定量试剂盒进行检测，与市场同类产品进行比较并应用于真实案件的检材检测。结果该人类DNA定量试剂盒能有效检测最低0.001 65 ng/μL的人类DNA、男女性比例为1∶15 000混合样品中6.25 pg/μL的男性DNA；样品中单独含有高达400 ng/μL腐殖酸和1 000 μmol/L血红素时，仍可准确检测DNA浓度；通过降解指数可以有效表征样品的降解程度；该试剂盒已成功应用于法医学实践。结论该人类DNA定量试剂盒检测准确、可靠，能准确反映DNA降解情况及含抑制剂情况，在定量准确度、男女性混合样品比例测定、含抑制剂情况等方面均具有良好的效能，在法医学案件检验等领域具有应用潜力。

关键词: 法医遗传学, DNA定量, 短串联重复序列, 实时定量PCR, 检测效能

Abstract:

Objective To verify the efficacy of a domestic human DNA quantification kit based on real-time fluorescence quantitative PCR in detecting the total human DNA concentration, male DNA concentration in mixed male/female DNA samples, the degree of DNA degradation and inhibitor tolerance. Methods Samples with different concentrations, different male/female ratios, different concentrations of inhibitors, and different degradation degrees were tested using the domestic human DNA quantification kit based on real-time fluorescence quantitative PCR. This kit was compared with a similar product on the market and was applied to the detection of DNA from real cases. Results This human DNA quantification kit can effectively detect human DNA as low as 0.001 65 ng/μL, and 6.25 pg/μL of male DNA in mixed samples with a male-to-female ratio of 1∶15 000. Even when the sample contains as high as 400 ng/μL of humic acid or 1 000 μmol/L of hemin alone, the DNA concentration can still be accurately detected. The degradation index can effectively characterize the degradation degree of the sample. This kit has been successfully applied in forensic practice. Conclusion This human DNA quantification kit is accurate and reliable in detection. It can accurately reflect the degradation of DNA and inhibitor tolerance. It has good performance in quantitative accuracy, determination of the male/female ratio in mixed samples, and inhibitor tolerance. It has application potential in forensic case examination.

Key words: forensic genetics, DNA quantification, short tandem repeat （STR）, real-time quantitative PCR, detection effectiveness

中图分类号:

陈静, 王亚萍, 冯云鹏, 胡晓欣, 贾振军, 刘洪迪, 严安心, 李永久, 彭柱, 刘志芳, 陈健刚. 国产人类DNA定量试剂盒的验证及法医学应用[J]. 法医学杂志, 2025, 41(3): 252-259.

Jing CHEN, Ya-ping WANG, Yun-peng FENG, Xiao-xin HU, Zhen-jun JIA, Hong-di LIU, An-xin YAN, Yong-jiu LI, Zhu PENG, Zhi-fang LIU, Jian-gang CHEN. Validation and Forensic Application of a Domestic Human DNA Quantitative Detection Kit[J]. Journal of Forensic Medicine, 2025, 41(3): 252-259.

图/表 7

参考文献 31

[1]	BUTLER J M. The future of forensic DNA analysis[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2015，370（1674）：20140252. doi：10.1098/rstb.2014.0252 .
[2]	洪贤慷，刘祖洞. 重组DNA技术在法医物证鉴定中的应用[J].法医学杂志，1986，2（3）：29-33.
	HONG X K， LIU Z D. Application of recombinant DNA technology in forensic evidence identification[J]. Fayixue Zazhi，1986，2（3）：29-33.
[3]	李莉，柳燕，何根兰，等. 法医物证学DNA检验现状及展望[J].法医学杂志，2002，18（1）：60-62.
	LI L， LIU Y， HE G L， et al. Current status and prospects of DNA identification in forensic genetics[J]. Fayixue Zazhi，2002，18（1）：60-62.
[4]	HADDRILL P R. Developments in forensic DNA analysis[J]. Emerg Top Life Sci，2021，5（3）：381-393. doi：10.1042/ETLS20200304 .
[5]	陈璐，周喆，王升启. 陈旧骸骨DNA身份鉴定的法医学进展[J].法医学杂志，2023，39（5）：478-486. doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2021.511209 .
	CHEN L， ZHOU Z， WANG S Q. Process of forensic medicine in DNA identification of aged human remains[J]. Fayixue Zazhi，2023，39（5）：478-486.
[6]	KLINE M C， DUEWER D L， REDMAN J W， et al. NIST Mixed Stain Study 3： DNA quantitation accuracy and its influence on short tandem repeat multiplex signal intensity[J]. Anal Chem，2003，75（10）：2463-2469. doi：10.1021/ac026410i .
[7]	BARBISIN M， FANG R， O’SHEA C E， et al. Developmental validation of the Quantifiler Duo DNA Quantification kit for simultaneous quantification of total human and human male DNA and detection of PCR inhibitors in biological samples[J]. J Forensic Sci，2009，54（2）：305-319. doi：10.1111/j.1556-4029.2008.00951.x .
[8]	KAYE D H. The forensic debut of the NRC’s DNA report： Population structure， ceiling frequencies and the need for numbers[J]. Genetica，1995，96（1/2）：99-105. doi：10.1007/BF01441155 .
[9]	HAYN S， WALLACE M M， PRINZ M， et al. Evaluation of an automated liquid hybridization method for DNA quantitation[J]. J Forensic Sci，2004，49（1）：87-91. doi：10.1520/JFS2003124 .
[10]	胡学俊，罗忠训，陈升. 几种微量DNA定量测定方法的比较[J].湖北大学学报（自然科学版），1991，13（4）：380-384.
	HU X J， LUO Z X， CHEN S. A comparision of several methods for measuring trace DNA[J]. Hubei Daxue Xuebao （Natural science），1991，13（4）：380-384.
[11]	WALSH P S， VARLARO J， REYNOLDS R. A rapid chemiluminescent method for quantitation of human DNA[J]. Nucleic Acids Res，1992，20（19）：5061-5065. doi：10.1093/nar/20.19.5061 .
[12]	GREEN R L， ROINESTAD I C， BOLAND C， et al. Developmental validation of the quantifiler real-time PCR kits for the quantification of human nuclear DNA samples[J]. J Forensic Sci，2005，50（4）：809-825.
[13]	BARBISIN M， SHEWALE J G. Assessment of DNA extracted from forensic samples prior to genotyping[J]. Forensic Sci Rev，2010，22（2）：199-214.
[14]	SWANGO K L， TIMKEN M D， CHONG M D， et al. A quantitative PCR assay for the assessment of DNA degradation in forensic samples[J]. Forensic Sci Int，2006，158（1）：14-26. doi：10.1016/j.forsciint.2005.04.034 .
[15]	VAN OORSCHOT R A， BALLANTYNE K N， MITCHELL R J. Forensic trace DNA： A review[J]. Investig Genet，2010，1（1）：14. doi：10.1186/2041-2223-1-14 .
[16]	党华伟，毛炯，王惠，等. 疑难生物检材法医DNA检验的现状与进展[J].法医学杂志，2012，28（1）：52-54. doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2012.01.013 .
	DANG H W， MAO J， WANG H， et al. Research status and prospects of DNA test on difficult specimens[J]. Fayixue Zazhi，2012，28（1）：52-54.
[17]	王鑫，陈维忠，张健，等. miniSTR基因座及其检测系统在降解检材中的法医学应用[J].法医学杂志，2018，34（5）：532-537. doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2018.05.019 .
	WANG X， CHEN W Z， ZHANG J， et al. Application of miniSTR loci and its detection system for degraded materials in forensic medicine[J]. Fayixue Zazhi，2018，34（5）：532-537.
[18]	CROPPER E， COBLE M D， KAVLICK M F. Assessment of human nuclear and mitochondrial DNA qPCR assays for quantification accuracy utilizing NIST SRM 2372a[J]. Forensic Sci Int Genet，2022，59：102711. doi：10.1016/j.fsigen.2022.102711 .
[19]	LIANG J W， COYLE H M. A short interspersed nuclear element-based quantitative PCR assay for simultaneous human and dog DNA detection and quantification[J]. Biotechniques，2021，70（3）：175-180. doi：10.2144/btn-2020-0144 .
[20]	DONIEC A， JANUŁA M， GRZMIL P， et al. Assessing the utility of quantitative and qualitative metrics in the DNA quantification process of skeletal remains for autosomal and Y-chromosome STR amplification purposes[J]. Forensic Sci Int Genet，2022，60：102751. doi：10.1016/j.fsigen.2022.102751 .
[21]	BONNETTE M D. QIAGEN’s Investigator^® Quantiplex^® Pro Kit[M]// CONNON C C. Forensic DNA analysis： Methods and protocols. New York： Humana Press，2023：189-204.
[22]	GAO Y， YANG X F， CHEN H， et al. A pangenome reference of 36 Chinese populations[J]. Nature，2023，619（7968）：112-121. doi：10.1038/s41586-023-06173-7 .
[23]	BARBISIN M， FANG R， O’SHEA C E， et al. A multiplexed system for quantification of human DNA and human male DNA and detection of PCR inhibitors in biological samples[J]. Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2008，1（1）：13-15. doi：10.1016/j.fsigss.2007.10.197 .
[24]	GREEN R L， ROINESTAD I C， BOLAND C， et al. Developmental validation of the quantifiler real-time PCR kits for the quantification of human nuclear DNA samples[J]. J Forensic Sci，2005，50（4）：809-825. doi：10.1520/JFS2004478 .
[25]	刘京，何传锦，张科，等. 法医SNP系谱推断技术助破23年冷案1例[J].法医学杂志，2023，39（3）：312-314. doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2023.530103 .
	LIU J， HE C J， ZHANG K， et al. Forensic SNP genealogy inference technology helps solve a 23-year cold case： A case report[J]. Fayixue Zazhi，2023，39（3）：312-314.
[26]	KAYSER M. Forensic use of Y-chromosome DNA： A general overview[J]. Hum Genet，2017，136（5）：621-635. doi：10.1007/s00439-017-1776-9 .
[27]	VAJPAYEE K， DASH H R， PAREKH P B， et al. PCR inhibitors and facilitators — Their role in forensic DNA analysis[J]. Forensic Sci Int，2023，349：111773. doi：10.1016/j.forsciint.2023.111773 .
[28]	丁东雪，丁梅. 多重置换扩增在含抑制物检材中的应用[J].法医学杂志，2016，32（5）：342-345. doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.05.006 .
	DING D X， DING M. Application of multiple displacement amplification in samples with inhibitors[J]. Fayixue Zazhi，2016，32（5）：342-345.
[29]	FUNES-HUACCA M E， OPEL K， THOMPSON R， et al. A comparison of the effects of PCR inhibition in quantitative PCR and forensic STR analysis[J]. Electrophoresis，2011，32（9）：1084-1089. doi：10.1002/elps.201000584 .
[30]	MACIEJEWSKA A， JAKUBOWSKA J， PAWŁOWSKI R. Whole genome amplification of degraded and nondegraded DNA for forensic purposes[J]. Int J Legal Med，2013，127（2）：309-319. doi：10.1007/s00414-012-0764-9 .
[31]	罗光华，陈玉川，成建定，等. DNA降解与腐败尸体死亡时间的相关性[J].法医学杂志，2006，22（1）：7-9. doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2006.01.003 .
	LUO G H， CHEN Y C， CHENG J D， et al. Relationship between DNA degradation and postmortem interval of corrupt corpse[J]. Fayixue Zazhi，2006，22（1）：7-9.

实际质量浓度/ （ng·μL^-1）	AS		AL		Y
实际质量浓度/ （ng·μL^-1）	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%
0.001 65	0.001 70±0.001 00	3.03	0.001 30±0.001 00	21.21	0.000 70±0.000 00	57.58
0.003 3	0.003 20±0.000 00	3.03	0.003 80±0.001 00	15.15	0.002 90±0.001 00	12.12
0.005	0.004 90±0.001 00	2.00	0.005 00±0.001 00	0.00	0.003 30±0.002 00	34.00
0.01	0.011 70±0.001 00	17.00	0.011 40±0.000 00	14.00	0.009 50±0.002 00	5.00
0.033	0.035 20±0.002 00	6.66	0.035 10±0.002 00	6.36	0.034 10±0.005 00	3.33
0.05	0.051 20±0.002 00	2.40	0.054 30±0.004 00	8.60	0.054 20±0.002 00	8.40
0.1	0.097 00±0.004 00	3.00	0.100 40±0.004 00	0.40	0.109 60±0.003 00	9.60
0.5	0.496 00±0.012 00	0.80	0.482 40±0.006 00	3.52	0.509 20±0.020 00	1.84
1	0.984 70±0.012 00	1.53	0.932 70±0.023 00	6.73	1.012 90±0.030 00	1.29
5	4.945 00±0.042 00	1.10	5.088 00±0.162 00	1.76	4.951 50±0.096 00	0.97
10	9.838 5 0±0.011 00	1.62	10.300 00±0.110 00	3.00	10.222 00±0.328 00	2.22
20	20.030 00±0.000 00	0.15	21.425 00±0.125 00	7.13	23.020 00±0.070 00	15.10
40	38.620 00±1.790 00	3.45	44.650 00±0.630 00	11.63	51.250 00±0.880 00	28.13
50	50.375 00±0.905 00	0.75	50.190 00±0.910 00	0.38	68.315 00±2.515 00	36.63

实际质量浓度/ （ng·μL^-1）	AS		AL		Y
实际质量浓度/ （ng·μL^-1）	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%
0.001 65	0.001 70±0.001 00	3.03	0.001 30±0.001 00	21.21	0.000 70±0.000 00	57.58
0.003 3	0.003 20±0.000 00	3.03	0.003 80±0.001 00	15.15	0.002 90±0.001 00	12.12
0.005	0.004 90±0.001 00	2.00	0.005 00±0.001 00	0.00	0.003 30±0.002 00	34.00
0.01	0.011 70±0.001 00	17.00	0.011 40±0.000 00	14.00	0.009 50±0.002 00	5.00
0.033	0.035 20±0.002 00	6.66	0.035 10±0.002 00	6.36	0.034 10±0.005 00	3.33
0.05	0.051 20±0.002 00	2.40	0.054 30±0.004 00	8.60	0.054 20±0.002 00	8.40
0.1	0.097 00±0.004 00	3.00	0.100 40±0.004 00	0.40	0.109 60±0.003 00	9.60
0.5	0.496 00±0.012 00	0.80	0.482 40±0.006 00	3.52	0.509 20±0.020 00	1.84
1	0.984 70±0.012 00	1.53	0.932 70±0.023 00	6.73	1.012 90±0.030 00	1.29
5	4.945 00±0.042 00	1.10	5.088 00±0.162 00	1.76	4.951 50±0.096 00	0.97
10	9.838 5 0±0.011 00	1.62	10.300 00±0.110 00	3.00	10.222 00±0.328 00	2.22
20	20.030 00±0.000 00	0.15	21.425 00±0.125 00	7.13	23.020 00±0.070 00	15.10
40	38.620 00±1.790 00	3.45	44.650 00±0.630 00	11.63	51.250 00±0.880 00	28.13
50	50.375 00±0.905 00	0.75	50.190 00±0.910 00	0.38	68.315 00±2.515 00	36.63

抑制剂	浓度	抑制指数	FastDirect 44Y		PowerPlex Y23
抑制剂	浓度	抑制指数	平均峰高/RFU	出峰率/%	平均峰高/RFU	出峰率/%
血红素/（μmol·L^-1）	0	0	3 790	100.00	4 469	100.00
	500	-0.1	2 334	100.00	6 089	100.00
	750	0.07	1 495	100.00	5 468	100.00
	1 000	3.03	1 219	65.04	3 920	100.00
	1 250	N/A	1 023	34.96	4 855	100.00
腐殖酸/（ng·μL^-1）	0	0	2 558	100.00	3 101	100.00
	100	0.11	2 425	100.00	3 466	100.00
	150	0.1	1 914	100.00	3 500	100.00
	200	0.28	914	97.56	3 036	100.00
	300	2.96	434	19.51	1 379	58.70
	400	N/A	0	0.00	698	10.87

抑制剂	浓度	抑制指数	FastDirect 44Y		PowerPlex Y23
抑制剂	浓度	抑制指数	平均峰高/RFU	出峰率/%	平均峰高/RFU	出峰率/%
血红素/（μmol·L^-1）	0	0	3 790	100.00	4 469	100.00
	500	-0.1	2 334	100.00	6 089	100.00
	750	0.07	1 495	100.00	5 468	100.00
	1 000	3.03	1 219	65.04	3 920	100.00
	1 250	N/A	1 023	34.96	4 855	100.00
腐殖酸/（ng·μL^-1）	0	0	2 558	100.00	3 101	100.00
	100	0.11	2 425	100.00	3 466	100.00
	150	0.1	1 914	100.00	3 500	100.00
	200	0.28	914	97.56	3 036	100.00
	300	2.96	434	19.51	1 379	58.70
	400	N/A	0	0.00	698	10.87

编号	定量质量浓度/（ng·μL^-1）	降解指数	降解程度	STR分型
编号	定量质量浓度/（ng·μL^-1）	降解指数	降解程度	出峰率/%	平均峰高/RFU
1	10.860 0	1.27	无降解	100.00	14 286
2	8.986 0	1.85	低程度	100.00	2 937
3	6.186 0	3.41	低程度	85.71	3 106
4	5.276 0	6.70	中程度	57.14	472
5	6.459 0	7.87	中程度	50.00	1 262
6	2.123 3	13.26	高程度	31.75	406
7	0.738 3	1 509.34	高程度	19.05	484
8	0.047 2	1.22	无降解	100.00	12 274
9	0.021 4	2.03	低程度	95.24	2 049
10	0.019 1	2.94	低程度	57.14	645
11	0.002 9	5.15	中程度	15.87	204
12	0.009 4	5.39	中程度	33.33	938
13	0.004 5	9.96	高程度	28.57	363
14	0.000 6	-	高程度	0.00	0