国产人类DNA定量试剂盒的验证及法医学应用

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2023.531101

摘要/Abstract

摘要：

目的验证一款基于实时荧光定量PCR的国产人类DNA定量试剂盒在检测人类DNA总浓度、男女性混合样品中男性DNA浓度、DNA降解程度和含抑制剂情况等方面的效能。方法将不同DNA浓度、不同男女性混合比例、不同抑制剂浓度和不同降解程度的样品使用一款基于实时荧光定量PCR的国产人类DNA定量试剂盒进行检测，与市场同类产品进行比较并应用于真实案件的检材检测。结果该人类DNA定量试剂盒能有效检测最低0.001 65 ng/μL的人类DNA、男女性比例为1∶15 000混合样品中6.25 pg/μL的男性DNA；样品中单独含有高达400 ng/μL腐殖酸和1 000 μmol/L血红素时，仍可准确检测DNA浓度；通过降解指数可以有效表征样品的降解程度；该试剂盒已成功应用于法医学实践。结论该人类DNA定量试剂盒检测准确、可靠，能准确反映DNA降解情况及含抑制剂情况，在定量准确度、男女性混合样品比例测定、含抑制剂情况等方面均具有良好的效能，在法医学案件检验等领域具有应用潜力。

关键词: 法医遗传学, DNA定量, 短串联重复序列, 实时定量PCR, 检测效能

Abstract:

Objective To verify the efficacy of a domestic human DNA quantification kit based on real-time fluorescence quantitative PCR in detecting the total human DNA concentration, male DNA concentration in mixed male/female DNA samples, the degree of DNA degradation and inhibitor tolerance. Methods Samples with different concentrations, different male/female ratios, different concentrations of inhibitors, and different degradation degrees were tested using the domestic human DNA quantification kit based on real-time fluorescence quantitative PCR. This kit was compared with a similar product on the market and was applied to the detection of DNA from real cases. Results This human DNA quantification kit can effectively detect human DNA as low as 0.001 65 ng/μL, and 6.25 pg/μL of male DNA in mixed samples with a male-to-female ratio of 1∶15 000. Even when the sample contains as high as 400 ng/μL of humic acid or 1 000 μmol/L of hemin alone, the DNA concentration can still be accurately detected. The degradation index can effectively characterize the degradation degree of the sample. This kit has been successfully applied in forensic practice. Conclusion This human DNA quantification kit is accurate and reliable in detection. It can accurately reflect the degradation of DNA and inhibitor tolerance. It has good performance in quantitative accuracy, determination of the male/female ratio in mixed samples, and inhibitor tolerance. It has application potential in forensic case examination.

Key words: forensic genetics, DNA quantification, short tandem repeat （STR）, real-time quantitative PCR, detection effectiveness

中图分类号:

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图/表 7

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实际质量浓度/ （ng·μL^-1）	AS		AL		Y
实际质量浓度/ （ng·μL^-1）	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%
0.001 65	0.001 70±0.001 00	3.03	0.001 30±0.001 00	21.21	0.000 70±0.000 00	57.58
0.003 3	0.003 20±0.000 00	3.03	0.003 80±0.001 00	15.15	0.002 90±0.001 00	12.12
0.005	0.004 90±0.001 00	2.00	0.005 00±0.001 00	0.00	0.003 30±0.002 00	34.00
0.01	0.011 70±0.001 00	17.00	0.011 40±0.000 00	14.00	0.009 50±0.002 00	5.00
0.033	0.035 20±0.002 00	6.66	0.035 10±0.002 00	6.36	0.034 10±0.005 00	3.33
0.05	0.051 20±0.002 00	2.40	0.054 30±0.004 00	8.60	0.054 20±0.002 00	8.40
0.1	0.097 00±0.004 00	3.00	0.100 40±0.004 00	0.40	0.109 60±0.003 00	9.60
0.5	0.496 00±0.012 00	0.80	0.482 40±0.006 00	3.52	0.509 20±0.020 00	1.84
1	0.984 70±0.012 00	1.53	0.932 70±0.023 00	6.73	1.012 90±0.030 00	1.29
5	4.945 00±0.042 00	1.10	5.088 00±0.162 00	1.76	4.951 50±0.096 00	0.97
10	9.838 5 0±0.011 00	1.62	10.300 00±0.110 00	3.00	10.222 00±0.328 00	2.22
20	20.030 00±0.000 00	0.15	21.425 00±0.125 00	7.13	23.020 00±0.070 00	15.10
40	38.620 00±1.790 00	3.45	44.650 00±0.630 00	11.63	51.250 00±0.880 00	28.13
50	50.375 00±0.905 00	0.75	50.190 00±0.910 00	0.38	68.315 00±2.515 00	36.63

实际质量浓度/ （ng·μL^-1）	AS		AL		Y
实际质量浓度/ （ng·μL^-1）	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%	测定质量浓度/（ng·μL^-1）	平均相对误差/%
0.001 65	0.001 70±0.001 00	3.03	0.001 30±0.001 00	21.21	0.000 70±0.000 00	57.58
0.003 3	0.003 20±0.000 00	3.03	0.003 80±0.001 00	15.15	0.002 90±0.001 00	12.12
0.005	0.004 90±0.001 00	2.00	0.005 00±0.001 00	0.00	0.003 30±0.002 00	34.00
0.01	0.011 70±0.001 00	17.00	0.011 40±0.000 00	14.00	0.009 50±0.002 00	5.00
0.033	0.035 20±0.002 00	6.66	0.035 10±0.002 00	6.36	0.034 10±0.005 00	3.33
0.05	0.051 20±0.002 00	2.40	0.054 30±0.004 00	8.60	0.054 20±0.002 00	8.40
0.1	0.097 00±0.004 00	3.00	0.100 40±0.004 00	0.40	0.109 60±0.003 00	9.60
0.5	0.496 00±0.012 00	0.80	0.482 40±0.006 00	3.52	0.509 20±0.020 00	1.84
1	0.984 70±0.012 00	1.53	0.932 70±0.023 00	6.73	1.012 90±0.030 00	1.29
5	4.945 00±0.042 00	1.10	5.088 00±0.162 00	1.76	4.951 50±0.096 00	0.97
10	9.838 5 0±0.011 00	1.62	10.300 00±0.110 00	3.00	10.222 00±0.328 00	2.22
20	20.030 00±0.000 00	0.15	21.425 00±0.125 00	7.13	23.020 00±0.070 00	15.10
40	38.620 00±1.790 00	3.45	44.650 00±0.630 00	11.63	51.250 00±0.880 00	28.13
50	50.375 00±0.905 00	0.75	50.190 00±0.910 00	0.38	68.315 00±2.515 00	36.63

抑制剂	浓度	抑制指数	FastDirect 44Y		PowerPlex Y23
抑制剂	浓度	抑制指数	平均峰高/RFU	出峰率/%	平均峰高/RFU	出峰率/%
血红素/（μmol·L^-1）	0	0	3 790	100.00	4 469	100.00
	500	-0.1	2 334	100.00	6 089	100.00
	750	0.07	1 495	100.00	5 468	100.00
	1 000	3.03	1 219	65.04	3 920	100.00
	1 250	N/A	1 023	34.96	4 855	100.00
腐殖酸/（ng·μL^-1）	0	0	2 558	100.00	3 101	100.00
	100	0.11	2 425	100.00	3 466	100.00
	150	0.1	1 914	100.00	3 500	100.00
	200	0.28	914	97.56	3 036	100.00
	300	2.96	434	19.51	1 379	58.70
	400	N/A	0	0.00	698	10.87

抑制剂	浓度	抑制指数	FastDirect 44Y		PowerPlex Y23
抑制剂	浓度	抑制指数	平均峰高/RFU	出峰率/%	平均峰高/RFU	出峰率/%
血红素/（μmol·L^-1）	0	0	3 790	100.00	4 469	100.00
	500	-0.1	2 334	100.00	6 089	100.00
	750	0.07	1 495	100.00	5 468	100.00
	1 000	3.03	1 219	65.04	3 920	100.00
	1 250	N/A	1 023	34.96	4 855	100.00
腐殖酸/（ng·μL^-1）	0	0	2 558	100.00	3 101	100.00
	100	0.11	2 425	100.00	3 466	100.00
	150	0.1	1 914	100.00	3 500	100.00
	200	0.28	914	97.56	3 036	100.00
	300	2.96	434	19.51	1 379	58.70
	400	N/A	0	0.00	698	10.87

编号	定量质量浓度/（ng·μL^-1）	降解指数	降解程度	STR分型
编号	定量质量浓度/（ng·μL^-1）	降解指数	降解程度	出峰率/%	平均峰高/RFU
1	10.860 0	1.27	无降解	100.00	14 286
2	8.986 0	1.85	低程度	100.00	2 937
3	6.186 0	3.41	低程度	85.71	3 106
4	5.276 0	6.70	中程度	57.14	472
5	6.459 0	7.87	中程度	50.00	1 262
6	2.123 3	13.26	高程度	31.75	406
7	0.738 3	1 509.34	高程度	19.05	484
8	0.047 2	1.22	无降解	100.00	12 274
9	0.021 4	2.03	低程度	95.24	2 049
10	0.019 1	2.94	低程度	57.14	645
11	0.002 9	5.15	中程度	15.87	204
12	0.009 4	5.39	中程度	33.33	938
13	0.004 5	9.96	高程度	28.57	363
14	0.000 6	-	高程度	0.00	0