DNA实验室人源性DNA污染TaqMan qPCR检测方法的建立及应用

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2023.531004

摘要/Abstract

摘要：

目的基于实时定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）技术，建立一种灵敏度高、特异性好的人源性DNA检测方法，以实现对DNA实验室中潜在DNA污染源的快速检测。方法以人18S rRNA基因的参考序列为模板，用Primer Express^®设计引物和探针，用矩阵法筛选最优引物-探针组合。用人18S rRNA基因靶标序列的PCR扩增产物构建质粒，并用质粒标准品绘制qPCR体系的标准曲线。参照《实时定量PCR实验发表所需最低信息指南》（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-time PCR Experiments，MIQE）要求，评估qPCR体系的特异性、灵敏度、重复性及应用效果。结果建立的qPCR体系的分析灵敏度为5.3×10^-5 ng/μL，对人源性DNA样本具有较好的特异性。qPCR体系的相关系数为0.999，扩增效率为100%，批次内和批次间变异系数均小于2%。结论建立的人源性DNA qPCR检测方法的特异性好、灵敏度高、稳定性好，可用于DNA实验室污染的快速检测和实验室环境中累积的人源性DNA的日常监控。

关键词: 法医遗传学, DNA污染, 实验室, 实时定量PCR（qPCR）, TaqMan探针, 法医DNA分析

Abstract:

Objective To establish a highly sensitive and specific method for detecting human DNA based on real-time quantitative PCR （qPCR） technique for the rapid detection of potential DNA contamination sources in DNA laboratories. Methods Primers and probes were designed with Primer Express^® software using the reference sequence of human 18S rRNA gene as a template, and the optimal prime-probe combination was screened by matrix method. The PCR products of the target sequence of human 18S rRNA gene were used to construct the plasmid, and a plasmid standard was used to draw the standard curve of the qPCR system. According to MIQE guidelines, the specificity, sensitivity, repeatability, and application effect of the qPCR system were evaluated. Results The sensitivity of qPCR system established in this study was 5.3×10^-5 ng/μL, which showed good specificity for human DNA samples. The correlation coefficient of the qPCR system was 0.999, and amplification efficiency was 100%. Both the intra-batch and inter-batch variation coefficients were less than 2%. Conclusion The established human DNA detection method based on qPCR technique has good specificity, high sensitivity, and good stability. It can be used for rapid detection of DNA contamination and daily monitoring of the accumulated human DNA in the laboratory environment.

Key words: forensic genetics, DNA contamination, laboratory, real time quantitative PCR （qPCR）, TaqMan probe, forensic DNA analysis

中图分类号:

沈高芳, 周咏松, 张健球, 嵇世有, 吴应锋, 尚昊, 朱波峰. DNA实验室人源性DNA污染TaqMan qPCR检测方法的建立及应用[J]. 法医学杂志, DOI: 10.12116/j.issn.1004-5619.2023.531004.

Gao-fang SHEN, Yong-song ZHOU, Jian-qiu ZHANG, Shi-you JI, Ying-feng WU, Hao SHANG, Bo-feng ZHU. Establishment and Application of TaqMan qPCR Detection Method for Human DNA Contamination in DNA Laboratory[J]. Journal of Forensic Medicine, DOI: 10.12116/j.issn.1004-5619.2023.531004.

图/表 6

图1 qPCR体系的特异性试验结果A：人和其他12种动物的扩增曲线；B：熔解曲线。

Fig. 1 Specificity test results of the qPCR system

表1 qPCR体系的灵敏度试验结果

Tab. 1 Sensitivity test results of the qPCR system

质粒质量浓度/（ng·μL^-1）	平均Ct值	检出率/%
5.3×10¹	13.59	100
5.3×10⁰	16.93	100
5.3×10^-1	20.24	100
5.3×10^-2	23.67	100
5.3×10^-3	26.91	100
5.3×10^-4	30.20	100
5.3×10^-5	33.51	100
5.3×10^-6	34.21	88
5.3×10^-7	35.40	50
5.3×10^-8	35.87	31

图2 质粒样本的扩增曲线（5.3×10-5 ng/μL，16次重复）

Fig. 2 Amplification plot of the plasmid samples（5.3×10-5 ng/μL， 16 replicates）

表2 qPCR体系的重复性试验结果

Tab. 2 Repeatability test results of the qPCR system

质粒质量浓度（ng·μL^-1）	批次内		批次间
质粒质量浓度（ng·μL^-1）	$x ¯$ ±SD	CV/%	$x ¯$ ±SD	CV/%
5.3×10¹	13.07±0.05	0.85	12.96±0.22	1.07
5.3×10^-2	22.76±0.14	0.74	23.05±0.17	1.13
5.3×10^-5	34.31±0.12	0.69	33.92±0.24	1.56

表2 qPCR体系的重复性试验结果

Tab. 2 Repeatability test results of the qPCR system

质粒质量浓度（ng·μL^-1）	批次内		批次间
质粒质量浓度（ng·μL^-1）	$x ¯$ ±SD	CV/%	$x ¯$ ±SD	CV/%
5.3×10¹	13.07±0.05	0.85	12.96±0.22	1.07
5.3×10^-2	22.76±0.14	0.74	23.05±0.17	1.13
5.3×10^-5	34.31±0.12	0.69	33.92±0.24	1.56

图3 qPCR体系的扩增效率A：标准曲线；B：qPCR扩增曲线。

Fig. 3 Amplification efficiency of the qPCR system

表3 收集的真实样本的qPCR检测结果

Tab. 3 qPCR detection results of the collected real samples

实验室区域	样本数/份	检出率/%	Ct值
案件受理室	7	100.00	36.90~38.63
物证预处理室	4	100.00	36.92~40.62
物证临时保管室	12	66.67	0.00~41.05
人员样本采样室	4	50.00	0.00~37.32
常规物证DNA提取室	16	43.75	0.00~39.28
微量物证DNA提取室	5	20.00	0.00~38.30
PCR体系配制室	7	28.57	0.00~41.06
PCR扩增室	12	41.67	0.00~40.81
PCR产物检测室	12	83.33	0.00~40.85
技术大楼顶层天台（对照区域）	3	0	0

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