人源性受磷蛋白稳定表达细胞系的构建

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2020.400909

摘要/Abstract

摘要： 目的

构建稳定表达人源性受磷蛋白（phospholamban，PLN）的细胞系，并初步探索其在心肌毒性机制研究中的应用。

方法

采用FastCloning方法将目的基因PLN的开放阅读框序列插入至真核表达载体pcDNA5/FRT/TO（以下简称pDFT），构建pDFT-PLN-Flag质粒，并与pOG44质粒共转染Flp-In^TM T-REx^TM 293细胞，实现目的基因的表达，通过潮霉素B抗性持续压力筛选出重组成功的单克隆细胞株。应用Western印迹法和间接免疫荧光法检验重组细胞目的蛋白的表达情况。对构建成功的细胞系进行乌头碱染毒后，通过Western印迹法，检测PLN磷酸化的变化。

结果

重组质粒PCR扩增及DNA电泳后含有与已知PLN基因片段大小一致的扩增产物，测序后与人源性PLN基因开放阅读框（open reading frame，ORF）序列一致。间接免疫荧光法和Western印迹法提示构建的可增殖细胞系，诱导调控下可稳定且较高水平表达人源性PLN。乌头碱浓度为1 μmol/L、染毒2 h时，PLN的Thr17位点磷酸化水平降低。

结论

该人源性细胞株可以稳定表达PLN，并可用于乌头碱在分子水平上对细胞影响机制的研究。

关键词: 法医病理学, 法医毒理学, 受磷蛋白, 人源性细胞系, 乌头碱, 生物化学, 分子生物学

Abstract: Objective

To construct a cell line that can stably express human phospholamban（PLN） and initially explore its application in the study of myocardial toxicity mechanism.

Methods

FastCloning method was used to insert the open reading frame sequence of target gene PLN into eukaryotic expression vector pcDNA5/FRT/TO（hereinafter referred to as pDFT） to construct the pDFT-PLN-Flag plasmid. The Flp-In^TM T-REx^TM 293 cells were generated by cotransfection of the constructed plasmid and pOG44 plasmid to express the target gene. Successfully recombined monoclonal cell lines were screened by hygromycin B resistance. Western blot and indirect immunofluorescence （IFA） were used to examine the expression of the target protein in recombinant cells. After the cell line was exposed to aconitine, it was verified by Western blot to detect changes in PLN protein phosphorylation.

Results

After PCR amplification of the recombinant plasmid and DNA electrophoresis, the length of the amplified product is the same as the known PLN gene fragment, which is consistent with the open reading frame （ORF） sequence of the human PLN gene after sequencing. IFA and Western blot showed that the constructed proliferation cell line can stably express high levels of human PLN under induction and regulation. Preliminary results showed that the phosphorylation level of Thr17-PLN decreased after two hours of exposure to 1 μmol/L aconitine.

Conclusion

This human cell line can stably express PLN and can be used to study the mechanism of action of aconitine on the cell at molecular level.

Key words: forensic pathology, forensic toxicology, phospholamban, human-derived cell line, aconitine, biochemistry, molecular biology

中图分类号:

DF795.1

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图/表 5

图1 转染成功的细胞中基因测序结果阴影区域为人源性PLN基因ORF序列。

Fig. 1 Gene sequencing results in successfully transfected cells

图2 间接免疫荧光法检测hPLN-293细胞中PLN表达

Fig. 2 Indirect immunofluorescence detection of PLN expression in hPLN-293 cells

	FITC	DAPI	FITC与DAPI重叠
阴性对照组
未加Dox诱导组
加入Dox诱导组

图3 Western印迹法检测hPLN-293细胞中PLN的表达量

Fig. 3 PLN expression in hPLN-293 cells detected by Western blot

表1 Dox诱导对hPLN-293细胞中PLN相对表达量的影响 (xˉ±s)

Tab. 1 Effects of Dox induction on the relative expression of PLN in hPLN-293 cells

组别	第1代细胞		第5代细胞		第10代细胞
组别	n	PLN相对表达量	n	PLN相对表达量	n	PLN相对表达量
未加Dox诱导	2	0.24	3	0.29±0.23	3	0.21±0.09
加入Dox诱导	2	1.24	3	1.66±0.15^1）	3	1.19±0.22^1）

图4 Western印迹法检测乌头碱染毒对hPLN-293细胞中PLN Thr17位点磷酸化水平的影响

Fig. 4 Effects of aconitine exposure on the phosphorylation level of Thr17 site of PLN in hPLN-293 cells detected by Western blot

	无毒组	染毒组
Thr17-P-PLN
PLN
GAPDH

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