miR-888和miR-891a的双重微滴式数字PCR检测在精液鉴定中的应用

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2021.510802

法医学杂志 ›› 2022, Vol. 38 ›› Issue (6): 719-725.DOI: 10.12116/j.issn.1004-5619.2021.510802

miR-888和miR-891a的双重微滴式数字PCR检测在精液鉴定中的应用

魏孙祥¹^,²(), 陈惠香¹^,², 胡胜², 赵一霞², 石慧霞², 王哲², 李文², 季安全²(), 孙启凡²()

^1.山西医科大学法医学院，山西太原 030001
^2.公安部鉴定中心现场物证溯源技术国家工程实验室法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038

收稿日期:2021-08-26 发布日期:2022-12-25 出版日期:2022-12-28
通讯作者: 季安全,孙启凡
作者简介:季安全，男，硕士，主任法医师，主要从事法医遗传学研究；E-mail：aqjdna@163.com
孙启凡，女，博士，警务技术正高级职称，主要从事法医遗传学研究；E-mail：sunqifan@cifs.gov.cn
魏孙祥（1995—），男，硕士，主要从事法医遗传学研究；E-mail：1158673871@qq.com
基金资助:
公安部科技强警基础工作专项(2019GABJC13);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2019JB010)

Application of Duplex Droplet Digital PCR Detection of miR-888 and miR-891a in Semen Identification

Sun-xiang WEI¹^,²(), Hui-xiang CHEN¹^,², Sheng HU², Yi-xia ZHAO², Hui-xia SHI², Zhe WANG², Wen LI², An-quan JI²(), Qi-fan SUN²()

^1.School of Forensic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
^2.Key Laboratory of Forensic Genetics, Ministry of Public Security, National Engineering Laboratory for Forensic Science, Institute of Forensic Science, Beijing 100038, China

Received:2021-08-26 Online:2022-12-25 Published:2022-12-28
Contact: An-quan JI,Qi-fan SUN

摘要/Abstract

摘要：

目的利用微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术建立可同时检测miR-888和miR-891a的体系，并评估其在精液鉴定中的应用价值。方法通过设计不同荧光修饰的报告基团的水解探针实现对miR-888和miR-891a的双重ddPCR检测，对5种体液（外周血、月经血、精液、唾液、阴道分泌液）共75份样本进行检测，采用Mann-Whitney U检验进行差异性分析，通过ROC曲线分析评估miR-888和miR-891a区分精液的能力并获得鉴别的最佳截断值。结果该体系双重检测与单独检测结果差异无统计学意义，检测灵敏度可达到0.1 ng总RNA，批内与批间变异系数均小于15%。经双重ddPCR检测，精液中miR-888和miR-891a的表达量均高于其他体液。经ROC曲线分析，miR-888的AUC为0.976，最佳截断值为2.250 copies/μL，判别正确率为97.33%；miR-891a的AUC为1.000，最佳截断值为1.100 copies/μL，判别正确率为100%。结论本研究成功建立了双重ddPCR检测miR-888和miR-891a的方法，体系的稳定性和重复性良好，可用于精液鉴定，miR-888和miR-891a均具有较高的精液鉴别能力，且miR-891a的判别正确率更高。

关键词: 法医遗传学, 微滴式数字聚合酶链反应, 微小核糖核酸, 精液, miR-888, miR-891a

Abstract:

Objective To establish a system for simultaneous detection of miR-888 and miR-891a by droplet digital PCR （ddPCR）, and to evaluate its application value in semen identification. Methods The hydrolysis probes with different fluorescence modified reporter groups were designed to realize the detection of miR-888 and miR-891a by duplex ddPCR. A total of 75 samples of 5 body fluids （including peripheral blood, menstrual blood, semen, saliva and vaginal secretion） were detected. The difference analysis was conducted by Mann-Whitney U test. The semen differentiation ability of miR-888 and miR-891a was evaluated by ROC curve analysis and the optimal cut-off value was obtained. Results There was no significant difference between the dual-plex assay and the single assay in this system. The detection sensitivity was up to 0.1 ng total RNA, and the intra- and inter-batch coefficients of variation were less than 15%. The expression levels of miR-888 and miR-891a detected by duplex ddPCR in semen were both higher than those in other body fluids. ROC curve analysis showed that the AUC of miR-888 was 0.976, the optimal cut-off value was 2.250 copies/μL, and the discrimination accuracy was 97.33%; the AUC of miR-891a was 1.000, the optimal cut-off value was 1.100 copies/μL, and the discrimination accuracy was 100%. Conclusion In this study, a method for detection of miR-888 and miR-891a by duplex ddPCR was successfully established. The system has good stability and repeatability and can be used for semen identification. Both miR-888 and miR-891a have high ability to identify semen, and the discrimination accuracy of miR-891a is higher.

Key words: forensic genetics, droplet digital polymerase chain reaction （ddPCR）, microRNA, semen, miR-888, miR-891a

中图分类号:

DF795.2

魏孙祥, 陈惠香, 胡胜, 赵一霞, 石慧霞, 王哲, 李文, 季安全, 孙启凡. miR-888和miR-891a的双重微滴式数字PCR检测在精液鉴定中的应用[J]. 法医学杂志, 2022, 38(6): 719-725.

Sun-xiang WEI, Hui-xiang CHEN, Sheng HU, Yi-xia ZHAO, Hui-xia SHI, Zhe WANG, Wen LI, An-quan JI, Qi-fan SUN. Application of Duplex Droplet Digital PCR Detection of miR-888 and miR-891a in Semen Identification[J]. Journal of Forensic Medicine, 2022, 38(6): 719-725.

图/表 4

表1 miR-888、miR-891a的成熟序列及引物和探针信息

Tab. 1 Information of mature sequences， primers and probes of miR-888 and miR-891a

miRNA	信息类型	序列（5'→3'）
miR-888	成熟序列	UACUCAAAAAGCUGUCAGUCA
	逆转录茎环引物	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGACTG
	特异性正向引物	AGGCGCTACTCAAAAAGCTGTC
	通用反向引物	CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA
	水解探针	6-FAM-CACTGGATACGACTGACT-MGB
miR-891a	成熟序列	UGCAACGAACCUGAGCCACUGA
	逆转录茎环引物	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGTG
	特异性正向引物	CACGCCTGCAACGAACCT
	通用反向引物	CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA
	水解探针	HEX-ATACGACTCAGTGGCTC-MGB

图1 双重ddPCR检测miR-888和miR-891a的扩增图通道1（蓝色）：miR-888；通道2（绿色）：miR-891a。

Fig. 1 Amplification plots of miR-888 and miR-891a detected by duplex ddPCR

图2 双重ddPCR检测体系的灵敏度检测结果A03~A06为外周血样本，B03~B06为月经血样本，C03~C06、D03~D06为精液样本，E03~E06为唾液样本，F03~F06为阴道分泌液样本。

Fig. 2 Sensitivity test results of duplex ddPCR detection system

图3 ROC曲线分析结果A：miR-888；B：miR-891a。

Fig. 3 Analysis results of ROC curve

参考文献 25

1	AN J H， SHIN K J， YANG W I， et al. Body fluid identification in forensics[J]. BMB Rep，2012，45（10）：545-553. doi：10.5483/bmbrep.2012.45.10.206 .
2	孙启凡，李冉冉，胡胜，等. 应用分子生物学技术鉴定体液斑迹组织来源的研究进展[J].刑事技术，2018，43（1）：47-52. doi：10.16467/j.1008-3650.2018.01.010 .
	SUN Q F， LI R R， HU S， et al. Progress and prospect of identifying body fluid source by molecular biology approaches[J]. Xingshi Jishu，2018，43（1）：47-52.
3	杨丹，李洋，孙启凡，等. 分子标志物microRNA在法医学中的研究进展[J].法医学杂志，2020，36（3）：374-378. doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2020.03.015 .
	YANG D， LI Y， SUN Q F， et al. Research progress on microRNA in forensic medicine as molecular markers[J]. Fayixue Zazhi，2020，36（3）：374-378.
4	王正，张霁，唐丹舟，等. microRNA的检测技术及其法医学应用前景[J].法医学杂志，2014，30（1）：55-59. doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2014.01.014 .
	WANG Z， ZHANG J， TANG D Z， et al. Detection technologies of microRNA and their prospects for forensic applications[J]. Fayixue Zazhi，2014，30（1）：55-59.
5	HE H， HAN N， JI C， et al. Identification of five types of forensic body fluids based on stepwise discriminant analysis[J]. Forensic Sci Int Genet，2020，48：102337. doi：10.1016/j.fsigen.2020.102337 .
6	LIU Y， HE H X， XIAO Z X， et al. A systematic analysis of miRNA markers and classification algorithms for forensic body fluid identification[J]. Brief Bioinform，2021，22（4）：bbaa324. doi：10.1093/bib/bbaa 324 .
7	何红霞，季安全，韩娜，等. 基于microRNA表达量及判别分析的外周血与月经血鉴别[J].法医学杂志，2020，36（4）：514-518，524. doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2020.04.016 .
	HE H X， JI A Q， HAN N， et al. Identification of peripheral blood and menstrual blood based on the expression level of microRNAs and discriminant analysis[J]. Fayixue Zazhi，2020，36（4）：514-518，524.
8	李冉冉，马星，李亚琳，等. 体液法医学鉴定miRNA检测方法的建立与应用[J].中国法医学杂志，2018，33（1）：6-10. doi：10.13618/j.issn.1001-5728.2018.01.002 .
	LI R R， MA X， LI Y L， et al. Establishment and application of miRNA detection method for forensic body fluid identification[J]. Zhongguo Fayixue Zazhi，2018，33（1）：6-10.
9	VOGELSTEIN B， KINZLER K W. Digital PCR[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（16）：9236-9241. doi：10.1073/pnas.96.16.9236 .
10	HINDSON B J， NESS K D， MASQUELIER D A， et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number[J]. Anal Chem，2011，83（22）：8604-8610. doi：10.1021/ac202028g .
11	王国力，季安全，李洋，等. miRNA鉴别体液研究中内参基因的选择与应用[J].刑事技术，2021，46（4）：383-388. doi：10.16467/j.1008-3650.2021.0025 .
	WANG G L， JI A Q， LI Y， et al. Selection and application of reference genes for studies of body fluid identification using miRNA[J]. Xingshi Jishu，2021，46（4）：383-388.
12	DOI H， TAKAHARA T， MINAMOTO T， et al. Droplet digital polymerase chain reaction （PCR） outperforms real-time PCR in the detection of environmental DNA from an invasive fish species[J]. Environ Sci Technol，2015，49（9）：5601-5608. doi：10.1021/ acs.est.5b00253 .
13	李冉冉，王兵，胡胜，等. 不同RNA提取方法的效能比较[J].刑事技术，2018，43（6）：431-435. doi：10.16467/j.1008-3650.2018.06.001 .
	LI R R， WANG B， HU S， et al. Comparative evaluation on different RNA extraction methods[J]. Xingshi Jishu，2018，43（6）：431-435.
14	胡伟，陈荣华，张晨，等. 微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量[J].法医学杂志，2014，30（5）：342-345. doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2014.05.006 .
	HU W， CHEN R H， ZHANG C， et al. Species identification and absolute quantification of biological samples by droplet digital PCR[J]. Fayixue Zazhi，2014，30（5）：342-345.
15	DONG L， ZHOU J， NIU C， et al. Highly accurate and sensitive diagnostic detection of SARS-CoV-2 by digital PCR[J]. Talanta，2021，224：121726. doi：10 .
	1016/j.talanta.2020.121726.
16	HEID C A， STEVENS J， LIVAK K J， et al. Real time quantitative PCR[J]. Genome Res，1996，6（10）：986-994. doi：10.1101/gr.6.10.986 .
17	LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408. doi：10.1006/meth.2001.1262 .
18	魏咏新，张西萌，魏海燕，等. 克罗诺阪崎肠杆菌微滴数字PCR定量方法的建立[J].质量安全与检验检测，2021，31（S1）：62-70.
	WEI Y X， ZHANG X M， WEI H Y， et al. Establishment of droplet digital PCR system for absolute quantitative detection of Cronobacter sakazakii [J]. Zhi-liang Anquan Yu Jianyan Jiance，2021，31（S1）：62-70.
19	KRAMER M F. Stem-loop RT-qPCR for miRNAs[J]. Curr Protoc Mol Biol，2011，Chapter 15：Unit15.10. doi：10.1002/0471142727.mb1510s95 .
20	KUTYAVIN I V， AFONINA I A， MILLS A， et al. 3′-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures[J]. Nucleic Acids Res，2000，28（2）：655-661. doi：10.1093/ nar/28.2.655 .
21	HU L， WU C， GUO C， et al. Identification of microRNAs predominately derived from testis and epididymis in human seminal plasma[J]. Clin Biochem，2014，47（10/11）：967-972. doi：10.1016/j.clinbio chem.2013.11.009 .
22	LEWIS H， LANCE R， TROYER D， et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration[J]. Cell Cycle，2014，13（2）：227-239. doi：10.4161/cc.26 984 .
23	WANG Z， ZHANG J， LUO H， et al. Screening and confirmation of microRNA markers for forensic body fluid identification[J]. Forensic Sci Int Genet，2013，7（1）：116-123. doi：10.1016/j.fsigen.2012.07.006 .
24	SEASHOLS-WILLIAMS S， LEWIS C， CALLOWAY C， et al. High-throughput miRNA sequencing and identification of biomarkers for forensically relevant biological fluids[J]. Electrophoresis，2016，37（21）：2780-2788. doi：10.1002/elps.201600258 .
25	RUELLE J， YFANTIS V， DUQUENNE A， et al. Validation of an ultrasensitive digital droplet PCR assay for HIV-2 plasma RNA quantification[J]. J Int AIDS Soc，2014，17（4 ）：19675. doi：10.7448/ias.17.4.19675 .

[1]	陶瑞旸, 王守宇, 袁春艳, 夏若成, 李成涛. 应用SNaPshot技术检测精液特异性cSNP遗传标记[J]. 法医学杂志, 2023, 39(5): 465-470.
[2]	王中华, 李淑瑾. 人类身高推断的分子生物学研究进展[J]. 法医学杂志, 2023, 39(5): 487-492.
[3]	张琦, 赵禾苗, 杨康, 陈静, 杨瑞琴, 王冲. 利用朴素贝叶斯和多元logistic回归构建月经血mRNA标志分析模型[J]. 法医学杂志, 2023, 39(5): 447-451.
[4]	陈璐, 周喆, 王升启. 陈旧骸骨DNA身份鉴定的法医学进展[J]. 法医学杂志, 2023, 39(5): 478-486.
[5]	郭科建, 黄磊, 李士林, 殷才湧, 汤真. 山东汉族人群37个Y-STR基因座多态性与突变调查[J]. 法医学杂志, 2023, 39(5): 501-506.
[6]	杨乐, 丛欣, 陈冲, 贾莉, 李惠芬, 马云龙, 石妍. 应用多种遗传标记鉴定疑似父子关系的全同胞关系1例[J]. 法医学杂志, 2023, 39(4): 424-427.
[7]	蒋志霞, 毛小慧, 衡素景. 母亲参与的姑侄亲缘关系鉴定1例[J]. 法医学杂志, 2023, 39(3): 326-328.
[8]	白雪, 马冠车, 付丽红, 李淑瑾, 张晓静. 生父性侵女儿法医学鉴定1例[J]. 法医学杂志, 2023, 39(3): 308-311.
[9]	臧钰, 李燃, 陈海英, 杨静怡, 乌日嘎, 孙宏钰. 应用法医系谱学鉴定寻亲案件1例[J]. 法医学杂志, 2023, 39(3): 323-325.
[10]	任贺, 刘志勇, 石妍, 陈冲, 贾莉, 陈滢, 刘雅诚, 严江伟. 强奸致孕形成完全性葡萄胎亲子鉴定2例[J]. 法医学杂志, 2023, 39(3): 315-318.
[11]	刘京, 何传锦, 张科, 于迪, 童梦洁, 马咪, 赵东, 李彩霞. 法医SNP系谱推断技术助破23年冷案1例[J]. 法医学杂志, 2023, 39(3): 312-314.
[12]	肖超, 黄代新. 常用亲缘关系指数的通用计算公式[J]. 法医学杂志, 2023, 39(3): 276-282.
[13]	孙宏钰. 法医学亲子和亲缘关系鉴定的挑战与展望[J]. 法医学杂志, 2023, 39(3): 229-230.
[14]	谭政, 马冠车, 付丽红, 张晓静, 王茜, 付光平, 杜情情, 李淑瑾. 生物学半同胞关系鉴定策略[J]. 法医学杂志, 2023, 39(3): 262-270.
[15]	王雨婷, 朱强, 胡渝涵, 尉艺凡, 侯婷芸, 张霁. 可疑父与孩子生母存在亲缘关系的PI计算[J]. 法医学杂志, 2023, 39(3): 271-275.

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