唾液菌群的直接PCR扩增-高分辨率熔解曲线分析及其法医学应用

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2021.511006

摘要/Abstract

摘要：

目的建立一种基于直接PCR（direct PCR，dPCR）扩增和高分辨率熔解（high resolution melting，HRM）曲线分析的唾液菌群快速检测技术，评估其法医学应用价值。方法离心收集唾液中的细菌后重悬于Tris-EDTA（TE）缓冲液，直接作为模板用于16S rDNA V4区的扩增和HRM曲线分析，即dPCR-HRM，计算样本HRM图谱相对于参考图谱的判型置信度（genotype confidence percentage，GCP）。以传统的试剂盒（kit）提取模板DNA后再行PCR-HRM（即kPCR-HRM）为参考，验证dPCR-HRM的可行性。用dPCR-HRM法分析梯度稀释模板、群体样本和模拟唾液斑样本，评估其灵敏度、分型能力和检材适应性。结果 dPCR-HRM法可在90 min内得到唾液菌群的HRM图谱，与kPCR-HRM法之间的GCP>95.85%。应用dPCR-HRM法，一般个体0.29 nL的唾液即可测得菌群HRM型。61例唾液样本可分为10种型，8 h之内的唾液斑与新鲜唾液分型相同（GCP>90.83%）。结论 dPCR-HRM技术可用于唾液菌群的快速分型，且具有成本低、操作简单等优点。

关键词: 法医遗传学, 高分辨率熔解, 聚合酶链反应, 唾液, 菌群结构

Abstract:

Objective To develop a rapid test for salivary bacterial community based on direct PCR （dPCR） and high resolution melting （HRM） curve analysis, to evaluate its application value in forensic medicine. Methods The salivary bacteria were collected by centrifugation and then resuspended in Tris-EDTA （TE） buffer, and directly used as the template for amplification and HRM curve analysis （dPCR-HRM） of the 16S rDNA V4 region. The genotype confidence percentage （GCP） of the HRM profiles compared with the reference profile was calculated. The template DNA was extracted by traditional kit and then PCR-HRM （namely kPCR-HRM） was used as reference to validate the feasibility of dPCR-HRM. The gradient dilution templates, population samples and simulated salivary stains were analyzed by dPCR-HRM to evaluate its sensitivity, typing ability and adaptability. Results Using dPCR-HRM method, the HRM profiles of salivary bacterial community were obtained within 90 minutes. The GCP between dPCR-HRM and kPCR-HRM was greater than 95.85%. For general individuals, the HRM type of bacterial community could be determined with 0.29 nL saliva by dPCR-HRM. The 61 saliva samples could be divided into 10 types. The typing of salivary stains deposited within 8 h was the same as those of fresh saliva （GCP>90.83%）. Conclusion dPCR-HRM technology can be used for rapid typing of salivary bacterial community, and has the advantage of low cost and simple operation.

Key words: forensic genetics, high resolution melting, polymerase chain reaction （PCR）, saliva, bacterial community

中图分类号:

DF795.2

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图/表 8

图1 多杀性巴氏杆菌16S rDNA V4区的PCR-HRM图谱A：熔解曲线；B：HRM图谱；C：预测的熔解曲线；D：预测的HRM图谱。

Fig. 1 PCR-HRM profiles of 16S rDNA V4 region of Pasteurella multocida

图2 唾液菌群的kPCR-HRM图谱A：唾液菌群的熔解曲线；B：唾液菌群的HRM图谱；C：同一样本不同浓度的HRM图谱。

Fig. 2 kPCR-HRM profiles of salivary bacterial community

图3 同一样本的dPCR-HRM和kPCR-HRM图谱

Fig. 3 dPCR-HRM and kPCR-HRM profiles of the same sample

图4 梯度稀释混检样本的dPCR-HRM图谱

Fig. 4 dPCR-HRM profiles of the mixed sample with gradient dilution

图5 不同个体唾液菌群的dPCR-HRM图谱

Fig. 5 dPCR-HRM profiles of salivary bacterial community of different individuals

图6 不同沉积时间唾液斑的dPCR-HRM图谱

Fig. 6 dPCR-HRM profiles of salivary stains with different deposition times

图7 10种唾液菌群型的归一化HRM图谱①~⑩指样本中检出的10种菌群型。

Fig. 7 Normalized HRM profiles of 10 bacterial community types in saliva

图8 10种唾液菌群型的熔解曲线A：熔解曲线；B：3D熔解曲线。①~⑩指样本中检出的10种菌群型。

Fig. 8 Melting curves of 10 bacterial community types in saliva

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