Comparison of Three Drowning‑related Plankton Testing Methods in Drowning Diagnosis

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2024.440606

Abstract

Abstract:

Objective To compare the application effects of plankton multiplex polymerase chain reaction-capillary electrophoresis （PCR-CE）, SYBR Green Ⅰ real-time quantitative PCR （qPCR） and microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy （MD-VF-Auto SEM） in the diagnosis of drowning. Methods Lung, liver and kidney tissues from 212 drowned corpses and 30 non-drowned corpses were examined respectively by the three drowning-related plankton testing methods, and the detection rates of plankton in each tissue by three methods were compared. Results In drowned corpses, the total detection rates of PCR-CE, qPCR, and MD-VF-Auto SEM were 93.9%, 96.2%, and 95.3%, respectively, with no statistically significant difference （P>0.05）. The detection rate of lung tissue by MD-VF-Auto SEM （100%） was higher than those of PCR-CE and qPCR （P<0.05）, and there was no significant difference in the detection rates of the three methods in liver or kidney tissues （P>0.05）. In non-drowning corpses, a small number of diatoms （less than 10 cells/10 g） were detected by MD-VF-Auto SEM method, only in liver and kidney tissues, while the other two methods yielded negative results for all tissues. Conclusion All three methods have good efficacy in the examination of drowned corpses. The MD-VF-Auto SEM method directly observes diatom morphological characteristics through scanning electron microscopy, and the qualitative and quantitative analyses are intuitive and accurate. It has great advantages in the examination of difficult degradation samples. The PCR-CE method and qPCR method have a low sample demand （0.5 g）, are easy to operate and have short detection time （4-7 h）. They are easy to be applied in the grassroots departments and are suitable for the rapid determination of drowned corpses in routin cases. The combination of the two DNA methods with the MD-VF-Auto SEM method can increase the detection rate of plankton, ensuring the reliability of examination results. This combined use is of significant importance in the application of drowning diagnosis.

Key words: forensic pathology, drowning, polymerase chain reaction-capillary electrophoresis （PCR-CE）, real-time quantitative PCR, microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy （MD-VF-Auto SEM）, plankton

CLC Number:

Xiao-feng ZHANG, Qin SU, Xiao-hui CHEN, Wei-bin WU, Dong-yun ZHENG, Jian ZHAO, Ling CHEN, Qu-yi XU, Chao LIU. Comparison of Three Drowning‑related Plankton Testing Methods in Drowning Diagnosis[J]. Journal of Forensic Medicine, 2025, 41(3): 244-251.

Figures/Tables 7

References 24

[1]	World Health Organization. Drowning[EB/OL]. （2023-7-25）[2024-06-01].
[2]	赵虎，刘超. 高级法医学[M].3版.郑州：郑州大学出版社，2021：228-234.
	ZHAO H， LIU C. Advanced forensic medicine[M]. 3rd ed. Zhengzhou： Zhengzhou University Press，2021：228-234.
[3]	ZHAO J， LIU C， HU S， et al. Microwave Digestion-Vacuum Filtration-Automated Scanning Electron Microscopy as a sensitive method for forensic diatom test[J]. Int J Leg Med，2013，127：459-463. doi：10.1007/s00414-012-0756-9 .
[4]	TIE J， UCHIGASAKI S， HASEBA T， et al. Direct and rapid PCR amplification using digested tissues for the diagnosis of drowning[J]. Electrophoresis，2010，31（14）：2411-2415. doi：10.1002/elps.200900754 .
[5]	VINAYAK V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death[J]. Electrophoresis，2020，41（24）：2144-2148. doi：10.1002/elps.202000100 .
[6]	UCHIYAMA T， KAKIZAKI E， KOZAWA S， et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death： Simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes[J]. Forensic Sci Int，2012，222（1/2/3）：11-26. doi：10.1016/j.forsciint.2012.04.029 .
[7]	广州市刑事科学技术研究所，公安部物证鉴定中心. 法庭科学硅藻检验技术规范微波消解-真空抽滤-显微镜法： [S].北京：中国标准出版社，2020.
	Guangzhou Institute of Criminal Science and Technology， National Engineering Laboratory for Forensic Science. Forensic sciences — Technical specifications for diatom inspection — Microwave digestion-vacuum filtration-microscopy： [S]. Beijing： Standards Press of China，2020.
[8]	YU Z， XU Q， XIAO C， et al. SYBR Green real-time qPCR method： Diagnose drowning more rapidly and accurately[J]. Forensic Sci Int，2021，321：110720. doi：10.1016/j.forsciint.2021.110720 .
[9]	XIAO C， XU Q， LI H， et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis[J]. Electrophoresis，2021，42（11）：1270-1278. doi：10.1002/elps.202000265 .
[10]	MING M， MENG X， WANG E. Evaluation of four digestive methods for extracting diatoms[J]. Forensic Sci Int，2007，170（1）：29-34. doi：10.1016/j.forsciint.2006.08.022 .
[11]	KAKIZAKI E， SONODA A， SHINKAWA N， et al. A new enzymatic method for extracting diatoms from organs of suspected drowning cases using papain： Optimal digestion and first practical application[J]. Forensic Sci Int，2019，297：204-216. doi：10.1016/j.forsciint.2019.02.008 .
[12]	KAKIZAKI E， OGURA Y， KOZAWA S， et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims： First metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing[J]. Forensic Sci Int，2012，220（1/2/3）：135-146. doi：10.1016/j.forsciint.2012.02.010 .
[13]	HUYS G， COOPMAN V， VAN VARENBERGH D， et al. Selective culturing and genus-specific PCR detection for identification of Aeromonas in tissue samples to assist the medico-legal diagnosis of death by drowning[J]. Forensic Sci Int，2012，221（1/2/3）：11-15. doi：10.1016/j.forsciint.2012.03.017 .
[14]	韦信贤，杨先乐，童桂香，等. 四重PCR检测致病性嗜水气单胞菌[J].中国人兽共患病学报，2013，29（6）：587-593. doi：10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2013.06.013 .
	WEI X X， YANG X L， TONG G X， et al. Detection of pathogenic Aeromonas hydrophila by quadruple PCR[J]. Zhongguo Renshou Gonghuanbing Xuebao，2013，29（6）：587-593.
[15]	SUTO M， ABE S， NAKAMURA H， et al. Phytoplankton gene detection in drowned rabbits[J]. Leg Med （Tokyo），2003，5（S1）：142-144. doi：10.1016/s1344-6223（02）00098-6 .
[16]	AOYAGI M， IWADATE K， FUKUI K， et al. A novel method for the diagnosis of drowning by detection of Aeromonas sobria with PCR method[J]. Leg Med，2009，11（6）：257-259. doi：10.1016/j.legalmed.2009.07.003 .
[17]	KANE M， FUKUNAGA T， MAEDA H， et al. The detection of picoplankton 16S rDNA in cases of drowning[J]. Int J Leg Med，1996，108：323-326. doi：10.1007/BF02432130 .
[18]	ZHAO J， LIU C， BARDEESI A S A， et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning： An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy[J]. J Forensic Sci，2017，62（6）：1638-1642. doi：10.1111/1556-4029.13455 .
[19]	KAKIZAKI E， KOZAWA S， IMAMURA N， et al. Detection of marine and freshwater bacterioplankton in immersed victims： Post-mortem bacterial invasion does not readily occur[J]. Forensic Sci Int，2011，211（1/2/3）：9-18. doi：10.1016/j.forsciint.2011.03.036 .
[20]	PEABODY A J. Diatoms and drowning — A review[J]. Med Sci Law，1980，20（4）：254-261. doi：10.1177/002580248002000406 .
[21]	TSUNEYA S， NAKAJIMA M， YOSHIDA M， et al. Detection of diatoms in a case of mud aspiration at a coastal area[J]. Leg Med，2024，66：102354. doi：10 .
	1016/j.legalmed.2023.102354.
[22]	YEN L Y， JAYAPRAKASH P T. Prevalence of diatom frustules in non-vegetarian foodstuffs and its implications in interpreting identification of diatom frustules in drowning cases[J]. Forensic Sci Int，2007，170（1）：1-7. doi：10.1016/j.forsciint.2006.08.020 .
[23]	杜宇坤，刘景建，康晓东，等. 硅藻通过消化道淋巴系统进入实验兔体内的途径[J].法医学杂志，2022，38（1）：67-70. doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2021.410607 .
	DU Y K， LIU J J， KANG X D， et al. Pathway of diatoms enter experimental rabbits through the lymphatic system of the digestive tract[J]. Fayixue Zazhi，2022，38（1）：67-70.
[24]	朱德全，李向阳，石河，等. 溺死猪肺及心室血硅藻分布观察[J].热带医学杂志，2015，15（2）：137-140. doi：10.3969/j.issn.1672-3619.2015.02.002 .
	ZHU D Q， LI X Y， SHI H， et al. The distribution of diatoms recovered from the lungs and ventricles blood of pigs died of drowning[J]. Redai Yixue Zazhi，2015，15（2）：137-140.

引物	引物序列（5′→3′）	产物长度/bp	目标物种
rbcL	F：ATTAGGTTTATCTGGTAAAAACTAC； R：TTCTCTCCAACGCATGAA	113	硅藻
UPA	F：GGGCGGTCGCCTCCC； R：CACCGTCAGATCACTAAGAGGCA	166	硅藻
16S rDNA	F：TATTGGTATTCTTACGCTTGGT； R：ATTAAATTAAACCAAGCGTTTGGT	156	蓝藻
rPOD	F：TTCACCTCGGCATAGGTCAG； R：GTACGCGCAACCTAGCAACAC	117	气单胞菌

引物	引物序列（5′→3′）	产物长度/bp	目标物种
rbcL	F：ATTAGGTTTATCTGGTAAAAACTAC； R：TTCTCTCCAACGCATGAA	113	硅藻
UPA	F：GGGCGGTCGCCTCCC； R：CACCGTCAGATCACTAAGAGGCA	166	硅藻
16S rDNA	F：TATTGGTATTCTTACGCTTGGT； R：ATTAAATTAAACCAAGCGTTTGGT	156	蓝藻
rPOD	F：TTCACCTCGGCATAGGTCAG； R：GTACGCGCAACCTAGCAACAC	117	气单胞菌

引物	引物序列（5'→3'）	产物长度/bp	荧光标记	目标物种
rPOD-A	F：CCCCCAACGCATCATGC； R：CAAGTTTGAAGTGGCCAACA	101	FAM	气单胞菌
ND-A	F：ATTAGGTTTATCTGGTAAAAACTAC； R：TTCTCTCCAACGCATGAA	113	FAM	硅藻
rPOD-B	F：TTCACCTCGGCATAGGTCAG； R：GTACGCGCAACCTAGCAACAC	117	FAM	气单胞菌
CBR	F：GAAAGCTAGGGGAGCGAAT； R：GCGTGCGTACTCCCCAGGCG	132	FAM	蓝藻
ND-B	F：TACAGTTGTTGGTAAATTAGAA； R：GTGCATTTGACCACAGTGG	172	FAM	硅藻
HLYA-A	F：TCGCGAGATCTCGGGT； R：GAGCTGGCGCTGCTGGCTGA	105	HEX	气单胞菌
AER-A	F：CAATATATTGGGGTTGCTATGCA； R：AGCGAAGCTGGTCTGGATAG	111	HEX	气单胞菌
UPA	F：GGGCGGTCGCCTCCC； R：CACCGTCAGATCACTAAGAGGCA	166	HEX	硅藻
AER-B	F：CGAAGAGCTCTCCGGGCTT； R：TGGCACTCCGACAAGATGGCG	175	HEX	气单胞菌
HLYA-B	F：CCACGTGGCCTTCTACCTCA； R：TATCTTGGCATCCGGCGT	190	HEX	气单胞菌
AER-C	F：AGCCACCAACTGGTCCAAGACCAAC； R：TATCTTCACCGGGATCTTGGAGC	213	HEX	气单胞菌
HLYA-C	F：CGCGAGATCTCGGGT； R：GATCTTGAACTCGGTGCTG	368	HEX	气单胞菌

引物	引物序列（5'→3'）	产物长度/bp	荧光标记	目标物种
rPOD-A	F：CCCCCAACGCATCATGC； R：CAAGTTTGAAGTGGCCAACA	101	FAM	气单胞菌
ND-A	F：ATTAGGTTTATCTGGTAAAAACTAC； R：TTCTCTCCAACGCATGAA	113	FAM	硅藻
rPOD-B	F：TTCACCTCGGCATAGGTCAG； R：GTACGCGCAACCTAGCAACAC	117	FAM	气单胞菌
CBR	F：GAAAGCTAGGGGAGCGAAT； R：GCGTGCGTACTCCCCAGGCG	132	FAM	蓝藻
ND-B	F：TACAGTTGTTGGTAAATTAGAA； R：GTGCATTTGACCACAGTGG	172	FAM	硅藻
HLYA-A	F：TCGCGAGATCTCGGGT； R：GAGCTGGCGCTGCTGGCTGA	105	HEX	气单胞菌
AER-A	F：CAATATATTGGGGTTGCTATGCA； R：AGCGAAGCTGGTCTGGATAG	111	HEX	气单胞菌
UPA	F：GGGCGGTCGCCTCCC； R：CACCGTCAGATCACTAAGAGGCA	166	HEX	硅藻
AER-B	F：CGAAGAGCTCTCCGGGCTT； R：TGGCACTCCGACAAGATGGCG	175	HEX	气单胞菌
HLYA-B	F：CCACGTGGCCTTCTACCTCA； R：TATCTTGGCATCCGGCGT	190	HEX	气单胞菌
AER-C	F：AGCCACCAACTGGTCCAAGACCAAC； R：TATCTTCACCGGGATCTTGGAGC	213	HEX	气单胞菌
HLYA-C	F：CGCGAGATCTCGGGT； R：GATCTTGAACTCGGTGCTG	368	HEX	气单胞菌

组织	MD-VF-Auto SEM	浮游生物多重PCR-CE	SYBR Green ⅠqPCR
肺	212（100.0）	203（95.8）^1）	205（96.7）^1）
肝	187（88.2）	195（92.0）	199（93.9）
肾	197（92.9）	192（90.6）	204（96.2）
肺+肝/肾	202（95.3）	199（93.9）	204（96.2）