NETosis标记物CitH3在小鼠深静脉血栓中的时序性表达

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2024.441004

摘要/Abstract

摘要：

目的观察小鼠深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）发展过程中瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3，CitH3）的表达变化，探讨其在血栓形成时间推断中的应用价值。方法结扎小鼠下腔静脉（inferior vena cava，IVC）建立淤血诱导的血栓发生模型，分别于建模后0 h以及1、3、5、7、10、14、21 d过量麻醉处死小鼠，提取淤血的IVC段（建模后0 h）和形成血栓的IVC段（建模后1~21 d）。应用免疫组织化学染色和双重免疫荧光染色观察血栓形成期间中性粒细胞数量和CitH3的表达情况，使用蛋白质印迹法检测CitH3的蛋白表达水平。结果血栓形成过程中，CitH3主要在血栓内的中性粒细胞中表达。建模后0 h，淤血的IVC内可见少量中性粒细胞和个别CitH3阳性细胞。在建模后1~21 d形成的血栓中，中性粒细胞数量在建模后1 d达到峰值，随后逐渐减少；CitH3阳性细胞数量及其与中性粒细胞数量的比值在建模后1 d开始升高，于建模后5 d达到峰值，此后减少。CitH3蛋白的表达水平也在建模后1 d开始升高，于建模后5 d达到峰值。结论 CitH3在DVT形成期间的表达呈现时序性变化，有望成为推断血栓形成时间的生物学标记物。

关键词: 法医病理学, 深静脉血栓, 瓜氨酸化组蛋白H3, 时序性表达, 小鼠

Abstract:

Objective To detect the expression changes of citrullinated histone H3 （CitH3） during the development of deep vein thrombosis （DVT） in mice, and to explore its value in estimating the time to thrombosis. Methods The inferior vena cava （IVC） of mice was ligated to establish a thrombosis model induced by congestion. Mice were sacrificed under excessive anesthesia at 0 h, 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 10 d, 14 d and 21 d after the modeling, respectively. The congested IVC segments （0 h after modeling） and the thrombosed IVC segments （1-21 days after modeling） were extracted. Immunohistochemistry and double immunofluorescence staining were used to observe the number of neutrophils and the expression of CitH3 during thrombosis. Western blotting was used to detect the protein expression level of CitH3. Results During thrombosis, CitH3 was mainly expressed in neutrophils within the thrombus. A small number of neutrophils and a few CitH3-positive cells were observed at 0 h after modeling in the congested IVC. Between 1 d and 21 d after modeling, the number of neutrophils reached a peak at 1 d and gradually decreased. The number of CitH3-positive cells and their ratio to neutrophils began to increase at 1 d, reached a peak at 5 d after modeling, and then decreased. The expression level of CitH3 protein began to increase at 1 d and reached a peak at 5 d after modeling. Conclusion The expression of CitH3 during DVI shows temporal changes, and is expected to become a biological marker for estimating the formation time of thrombosis.

Key words: forensic pathology, deep vein thrombosis, citrullinated histone H3 （CitH3）, temporal expression, mice

中图分类号:

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图/表 5

表1 各组CitH3阳性细胞和中性粒细胞的数量及两者的比值 (n=5，x¯±s)

Tab. 1 The numbers of CitH3-positive cells andneutrophils， as well as their ratios in each group

组别	CitH3阳性细胞数量	中性粒细胞数量	C/N
建模后0 h	0.4 $±$ 0.5	8.6 $±$ 2.9	3.5 $±$ 4.8
建模后1 d	26.0 $±$ 5.0^1）2）	96.4 $±$ 10.8^1）2）	26.9 $±$ 3.0^1）2）
建模后3 d	40.4 $±$ 5.0^1）2）	77.8 $±$ 9.1^1）2）	52.0 $±$ 4.1^1）2）
建模后5 d	48.4 $±$ 5.9^1）2）	56.8 $±$ 6.9^1）2）	85.6 $±$ 8.5^1）2）
建模后7 d	25.2 $±$ 4.1^1）2）	47.8 $±$ 8.3^1）	53.1 $±$ 5.6^1）2）
建模后10 d	3.4 $±$ 1.5^2）	43.4 $±$ 6.1^1）	7.7 $±$ 2.7^2）
建模后14 d	1.2 $±$ 0.8	35.0 $±$ 6.2^1）	3.2 $±$ 2.1
建模后21 d	0.6 $±$ 0.5	20.2 $±$ 2.4^2）	2.8 $±$ 2.5

表1 各组CitH3阳性细胞和中性粒细胞的数量及两者的比值 (n=5，x¯±s)

Tab. 1 The numbers of CitH3-positive cells andneutrophils， as well as their ratios in each group

组别	CitH3阳性细胞数量	中性粒细胞数量	C/N
建模后0 h	0.4 $±$ 0.5	8.6 $±$ 2.9	3.5 $±$ 4.8
建模后1 d	26.0 $±$ 5.0^1）2）	96.4 $±$ 10.8^1）2）	26.9 $±$ 3.0^1）2）
建模后3 d	40.4 $±$ 5.0^1）2）	77.8 $±$ 9.1^1）2）	52.0 $±$ 4.1^1）2）
建模后5 d	48.4 $±$ 5.9^1）2）	56.8 $±$ 6.9^1）2）	85.6 $±$ 8.5^1）2）
建模后7 d	25.2 $±$ 4.1^1）2）	47.8 $±$ 8.3^1）	53.1 $±$ 5.6^1）2）
建模后10 d	3.4 $±$ 1.5^2）	43.4 $±$ 6.1^1）	7.7 $±$ 2.7^2）
建模后14 d	1.2 $±$ 0.8	35.0 $±$ 6.2^1）	3.2 $±$ 2.1
建模后21 d	0.6 $±$ 0.5	20.2 $±$ 2.4^2）	2.8 $±$ 2.5

图1 小鼠IVC血栓发展过程中CitH3和MPO的免疫组织化学染色结果

Fig. 1 Immunohistochemical staining results of CitH3 and MPO during the development of IVC thrombosis in mice

图2 建模后3 d血栓内CitH3和MPO的双重免疫荧光染色结果A：CitH3（红色）；B：MPO（绿色）；C：Hoechst 33258复染细胞核（蓝色）；D：荧光共定位的信号。

Fig. 2 Double immunofluorescence staining results of CitH3 and MPO in thrombus at 3 d after modeling

图3 建模后不同时间点CitH3蛋白的免疫印迹法检测结果

Fig. 3 Western blotting analysis of CitH3 protein expression at different time points after modeling

表2 各组CitH3蛋白的相对表达量 (n=5，x¯±s)

Tab. 2 Relative expression levels ofCitH3 protein in each group

组别	CitH3蛋白
建模后0 h	0.03 $±$ 0.01
建模后1 d	0.53 $±$ 0.05^1）2）
建模后3 d	0.74 $±$ 0.07^1）2）
建模后5 d	0.98 $±$ 0.12^1）2）
建模后7 d	0.47 $±$ 0.05^1）2）
建模后10 d	0.15 $±$ 0.03^1）2）
建模后14 d	0.09 $±$ 0.03
建模后21 d	0.04 $±$ 0.02

表2 各组CitH3蛋白的相对表达量 (n=5，x¯±s)

Tab. 2 Relative expression levels ofCitH3 protein in each group

组别	CitH3蛋白
建模后0 h	0.03 $±$ 0.01
建模后1 d	0.53 $±$ 0.05^1）2）
建模后3 d	0.74 $±$ 0.07^1）2）
建模后5 d	0.98 $±$ 0.12^1）2）
建模后7 d	0.47 $±$ 0.05^1）2）
建模后10 d	0.15 $±$ 0.03^1）2）
建模后14 d	0.09 $±$ 0.03
建模后21 d	0.04 $±$ 0.02

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