铁死亡在α-鹅膏毒肽诱导肝细胞损伤中的作用

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2024.440411

摘要/Abstract

摘要：

目的通过检测α-鹅膏毒肽暴露后小鼠肝组织铁沉积，小鼠肝细胞和L-02细胞氧化应激指标及铁死亡相关蛋白的表达，探究铁死亡是否参与α-鹅膏毒肽诱导的肝细胞损伤。方法建立α-鹅膏毒肽C57BL/6J小鼠中毒模型和L-02细胞染毒模型，采用Lillie二价铁染色、普鲁士蓝染色检测铁沉积情况，试剂盒检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平，蛋白质印迹法分析p53、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的表达。结果相较于对照组，α-鹅膏毒肽暴露后，小鼠肝组织中二价铁（Fe²⁺）和三价铁（Fe³⁺）阳性细胞率均升高（P<0.05），中（0.35 mg/kg）、高（0.45 mg/kg）剂量组肝组织及1 μmol/L α-鹅膏毒肽处理的L-02细胞中GSH水平降低、MDA水平升高，SOD和CAT活性下降（P<0.05）。此外，α-鹅膏毒肽呈浓度和时间依赖性上调p53表达，并抑制SLC7A11和GPX4的表达。结论铁死亡在α-鹅膏毒肽诱导的肝细胞损伤机制中发挥作用，铁死亡相关指标的异常可为α-鹅膏毒肽中毒的法医学鉴定提供参考。

关键词: 法医病理学, 法医毒理学, α-鹅膏毒肽, 铁死亡, 氧化应激, 肝损伤, L-02细胞, 小鼠

Abstract:

Objective To explore whether ferroptosis is involved in α-amanitin-induced hepatocyte injury by detecting iron deposition in mice liver tissues, oxidative stress indicators in hepatocytes and L-02 cells, and expressions of ferroptosis-related proteins after α-amanitin exposure. Methods The poisoning models of α-amanitin C57BL/6J mice and L-02 cell were established. The Lillie ferrous iron staining and Prussian blue staining were used to detect iron deposition; the kits were applied to detect the levels of superoxide dismutase （SOD）, catalase （CAT）, malondialdehyde （MDA）, and glutathione （GSH）. Western blotting was performed to analyze expressions of p53, solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11）, and glutathione peroxidase 4 （GPX4）. Results Compared with the control group, after α-amanitin exposure, positive cell rates of Fe²⁺ and Fe³⁺ in mice liver tissues increased significantly. In the liver tissues of medium （0.35 mg/kg） and high （0.45 mg/kg） dose groups and L-02 cells treated with 1 μmol/L α-amanitin, the level of GSH decreased, the level of MDA increased, and the activities of SOD and CAT decreased significantly. In addition, α-amanitin upregulated the expression of p53 in a concentration- and time-dependent manner and inhibited the expressions of SLC7A11 and GPX4. Conclusion Ferroptosis plays an important role in α-amanitin-induced hepatocyte injury. Abnormalities of ferroptosis-related indicators can provide references for the forensic identification of α-amanitin poisoning.

Key words: forensic pathology, forensic toxicology, α-amanitin, ferroptosis, oxidative stress, hepatic injury, L-02 cell, mice

中图分类号:

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图/表 9

表1 不同剂量α-鹅膏毒肽中毒小鼠肝组织中的铁沉积阳性细胞率 (n=10，x¯±s，%)

Tab. 1 Positive cell rates of iron deposition in mice liver tissues intoxicated with different doses of α‐amanitin

指标	对照组	α-鹅膏毒肽组
指标	对照组	0.25 mg/kg	0.35 mg/kg	0.45 mg/kg
Fe²⁺阳性细胞率	0.74±0.23	7.25±1.51^1）	17.27±1.80^1）2）	12.10±0.79^1）2）3）
Fe³⁺阳性细胞率	0.22±0.30	2.54±0.91^1）	5.52±0.67^1）	6.89±0.89^1）2）

图1 不同剂量α-鹅膏毒肽中毒小鼠肝组织中铁沉积情况蓝染细胞为Fe²⁺和Fe³⁺阳性细胞。

Fig. 1 Iron deposition in mice liver tissues intoxicated with different doses of α-amanitin

表2 不同剂量α-鹅膏毒肽中毒小鼠肝组织中氧化应激相关指标的变化情况 (n=10，x¯±s)

Tab. 2 Changes of oxidative stress‐related indexes in mice liver tissues intoxicated with different doses of α‐amanitin

指标	对照组	α-鹅膏毒肽组
指标	对照组	0.25 mg/kg	0.35 mg/kg	0.45 mg/kg
GSH/（μg·mg^-1）	30.62±1.15	24.59±0.91^1）	13.73±1.29^1）2）	14.92±1.57^1）2）
MDA/（nmol·mg^-1）	0.78±0.08	0.95±0.05	1.49±0.06^1）2）	1.63±0.06^1）2）
CAT/（U·mg^-1）	2.76±0.51	1.84±0.06^1）	0.60±0.20^1）2）	0.50±0.06^1）2）
SOD/（U·mg^-1）	7.41±0.55	5.58±0.35^1）	5.64±0.52^1）	3.83±0.36^1）2）

图2 不同剂量α-鹅膏毒肽中毒小鼠肝组织中铁死亡相关蛋白的表达变化

Fig. 2 Changes in expression of ferroptosis-relatedproteins in mice liver tissues intoxicatedwith different doses of α-amanitin

表3 不同剂量α-鹅膏毒肽中毒小鼠肝组织中铁死亡相关蛋白的相对表达量 (n=10，x¯±s)

Tab. 3 Relative expression levels of ferroptosis‐related proteins in mice liver tissues intoxicatedwith different doses of α‐amanitin

目的蛋白	对照组	α-鹅膏毒肽组
目的蛋白	对照组	0.25 mg/kg	0.35 mg/kg	0.45 mg/kg
p53	0.29±0.07	0.41±0.09	0.51±0.06^1）	0.69±0.14^1）2）
SLC7A11	1.21±0.12	0.97±0.15	0.77±0.16^1）	0.63±0.18^1）2）
GPX4	1.13±0.09	0.97±0.36	0.58±0.06^1）2）	0.45±0.23^1）2）

表4 1 μmol/L α-鹅膏毒肽作用于L-02细胞不同时长后氧化应激相关指标的变化情况 (n=3，x¯±s)

Tab. 4 Changes of oxidative stress-related indexes in L-02 cells exposed to1 μmol/L α-amanitin for different time periods

指标	暴露0 h	暴露6 h	暴露12 h	暴露24 h
GSH/（μg·mg^-1）	32.28±1.80	29.59±0.67	20.06±0.57^1）	12.58±1.67^1）2）
MDA/（nmol·mg^-1）	0.60±0.04	0.79±0.08	0.99±0.07	2.66±0.37^1）2）
CAT/（U·mg^-1）	9.16±0.91	8.09±0.63	7.59±0.56	4.38±0.69^1）2）
SOD/（U·mg^-1）	14.31±0.43	15.24±0.80	11.86±0.48^1）	9.45±0.49^1）2）

图3 α-鹅膏毒肽作用于L-02细胞后铁死亡相关蛋白的表达变化A：1 μmol/L α-鹅膏毒肽处理不同时长；B：不同浓度α-鹅膏毒肽处理24 h。

Fig. 3 Expression changes of ferroptosis-related proteins in L-02 cells exposed to α-amanitin

表5 1 μmol/L α-鹅膏毒肽作用于L-02细胞不同时长后铁死亡相关蛋白的相对表达量 (n=3，x¯±s)

Tab. 5 Relative expression levels of ferroptosis-related proteins in L-02 cells exposed to1 μmol/L α-amanitin for different time periods

目的蛋白	暴露0 h	暴露6 h	暴露12 h	暴露24 h
p53	0.60±0.13	0.72±0.17	0.95±0.07^1）	1.12±0.09^1）2）
GPX4	1.18±0.13	1.05±0.23	0.28±0.05^1）2）	0.69±0.32
SLC7A11	1.90±0.18	1.54±0.15^1）	0.96±0.07^1）	0.83±0.07^1）2）

表6 不同浓度α-鹅膏毒肽作用于L-02细胞24 h后铁死亡相关蛋白的相对表达量 (n=3，x¯±s)

Tab. 6 Relative expression levels of ferroptosis-related proteins in L-02 cells exposed todifferent concentrations of α-amanitin for 24 h

目的蛋白	0 μmol/L	0.1 μmol/L	0.5 μmol/L	1 μmol/L	5 μmol/L	10 μmol/L
p53	0.53±0.03	0.74±0.09	0.89±0.12	1.08±0.23^1）	1.13±0.19^1）2）	1.20±0.12^1）2）
GPX4	1.21±0.18	1.16±0.31	0.84±0.14	0.68±0.12^1）2）	0.56±0.09^1）2）	0.58±0.12^1）2）
SLC7A11	1.17±0.03	1.12±0.04	1.04±0.05	0.79±0.19^1）2）	0.76±0.09^1）2）	0.66±0.16^1）2）

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