CCK-8对甲基苯丙胺诱导细胞凋亡的抑制作用

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2021.310206

摘要/Abstract

摘要： 目的

研究八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide，CCK-8）与胆囊收缩素2受体（cholecystokinin 2 receptor，CCK2R）结合对甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）诱导的神经元凋亡的抑制作用，并探讨β-arrestin 2在CCK-8抑制METH诱导神经元凋亡中的信号转导机制。

方法

培养SH-SY5Y细胞和慢病毒转染的HEK293-CCK1R和HEK293-CCK2R细胞，应用干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）敲减β-arrestin 2的表达。采用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色和流式细胞术检测细胞的凋亡率，Western印迹法检测凋亡相关蛋白的表达。

结果

1 mmol/L、2 mmol/L METH可诱导SH-SY5Y细胞凋亡，核碎裂、固缩的细胞数量显著增加，凋亡相关蛋白Bax和活化型胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）表达升高。0.1 mmol/L和1 mmol/L CCK-8预处理均可逆转METH诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，并抑制METH引起的核碎裂、固缩的细胞数量增多以及凋亡相关蛋白的改变。慢病毒转染构建HEK293-CCK1R和HEK293-CCK2R细胞，发现CCK-8对METH诱导HEK293-CCK1R细胞凋亡相关蛋白的变化无明显影响，但可抑制METH诱导的HEK293-CCK2R细胞凋亡相关蛋白表达水平的升高。敲减SH-SY5Y细胞的β-arrestin 2表达后可阻断CCK-8对METH诱导细胞凋亡的抑制作用。

结论

CCK-8可与CCK2R结合，并通过激活β-arrestin 2信号抑制METH诱导的细胞凋亡。

关键词: 法医毒理学, 细胞凋亡, 甲基苯丙胺, 八肽胆囊收缩素, 神经元, 受体, β-制动蛋白

Abstract: Objective

To investigate the inhibitory effect of cholecystokinin octapeptide （CCK-8） binding to cholecystokinin 2 receptor （CCK2R） on methamphetamine （METH）-induced neuronal apoptosis, and to explore the signal transduction mechanism of β-arrestin 2 in CCK-8 inhibiting METH-induced neuronal apoptosis.

Methods

SH-SY5Y cell line was cultured, and HEK293-CCK1R and HEK293-CCK2R cell line were constructed by lentivirus transfection. Small interfering RNA （siRNA） was used to knockdown the expression of β-arrestin 2. Annexin Ⅴ-FITC/PI staining and flow cytometry were used to detect the apoptotic rate of cells, and Western blotting was used to detect the expression of apoptosis-related proteins.

Results

The apoptosis of SH-SY5Y cells was induced by 1 mmol/L and 2 mmol/L METH treatment, the number of nuclear fragmentation and pyknotic cells was significantly increased, and the expression of apoptosis-related proteins Bax and cleaved caspase-3 were increased. CCK-8 pre-treatment at the dose of 0.1 mmol/L and 1 mmol/L significantly reversed METH-induced apoptosis in SH-SY5Y cells, and inhibited cell nuclear fragmentation, pyknosis and the changes of apoptosis-related proteins induced by METH. In lentivirus transfected HEK293-CCK1R and HEK293-CCK2R cells, the results revealed that CCK-8 had no significant effect on METH-induced changes of apoptosis-related proteins in HEK293-CCK1R cells, but it could inhibit the expression level of apoptosis-related proteins in HEK293-CCK2R cells induced by METH. The inhibitory effect of CCK-8 on METH-induced apoptosis was blocked by the knockdown of β-arrestin 2 expression in SH-SY5Y cells.

Conclusion

CCK-8 can bind to CCK2R and exert an inhibitory effect on METH-induced apoptosis by activating the β-arrestin 2 signal.

Key words: forensic toxicology, apoptosis, methamphetamine, cholecystokinin octapeptide, neuron, receptor, β-arrestin

中图分类号:

DF795.1

张武华, 张明龙, 景伟伟, 谢冰, 毕海涛, 于峰, 丛斌, 马春玲, 文迪. CCK-8对甲基苯丙胺诱导细胞凋亡的抑制作用[J]. 法医学杂志, 2021, 37(6): 796-805.

Wu-hua ZHANG, Ming-long ZHANG, Wei-wei JING, Bing XIE, Hai-tao BI, Feng YU, Bin CONG, Chun-ling MA, Di WEN. Inhibitory Effect of CCK-8 on Methamphetamine-Induced Apoptosis[J]. Journal of Forensic Medicine, 2021, 37(6): 796-805.

导出引用管理器 EndNote|Ris|BibTeX

链接本文: http://www.fyxzz.cn/CN/10.12116/j.issn.1004-5619.2021.310206

http://www.fyxzz.cn/CN/Y2021/V37/I6/796

图/表 19

图1 Annexin Ⅴ-FITC/PI染色和流式细胞术检测SH-SY5Y细胞凋亡情况A：对照组；B：1 mmol/L METH组；C：2 mmol/L METH组。

Fig. 1 Apoptosis of SH-SY5Y cells detected by Annexin Ⅴ-FITC/PI staining and flow cytometry

表1 流式细胞术检测不同浓度METH对SH-SY5Y细胞凋亡率的影响 (n=3，xˉ±s，%)

Tab. 1 The apoptosis rate of SH-SY5Y cellstreated with different concentrations ofMETH detected by flow cytometry

组别	细胞凋亡率
对照	8.48±0.46
1 mmol/L METH	15.05±0.92^1）
2 mmol/L METH	17.06±1.73^1）

图2 Hoechst 33258染色检测凋亡细胞核的形态学改变A：对照组；B：1 mmol/L METH组；C：2 mmol/L METH组。红色箭头所示为碎裂、固缩的细胞核。Bar=25 μm。

Fig. 2 Morphological changes of apoptotic nucleidetected by Hoechst 33258 staining

图3 Western印迹法检测METH诱导SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白的表达

Fig. 3 Expression of apoptosis-related proteins induced byMETH in SH-SY5Y cells detected by Western blotting

表2 METH诱导SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白的表达变化 (n=3，xˉ±s)

Tab. 2 Expression of apoptosis-related proteinsinduced by METH in SH-SY5Y cells

组别	Bax	Bcl-2	cleaved caspase-3	Bax/Bcl-2
0 h	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
6 h	1.26±0.14	1.08±0.16	1.10±0.05	1.26±0.31
12 h	1.38±0.09^1）	0.99±0.14	1.41±0.08^1）	1.47±0.27
18 h	1.56±0.05^1）	0.79±0.09	1.46±0.06^1）	2.04±0.26^1）
24 h	1.54±0.16^1）	0.75±0.03	1.26±0.01^1）	2.04±0.17^1）

图4 Annexin Ⅴ-FITC/PI染色和流式细胞术检测SH-SY5Y细胞凋亡情况A：对照组；B：METH组；C：0.01 μmol/L CCK-8+METH组；D：0.1 μmol/L CCK-8+METH组；E：1 μmol/L CCK-8+METH组；F：0.01 μmol/L CCK-8组；G：0.1 μmol/L CCK-8组；H：1 μmol/L CCK-8组。

Fig. 4 Apoptosis of SH-SY5Y cells detected by Annexin Ⅴ-FITC/PI staining and flow cytometry

表3 流式细胞术检测不同浓度CCK-8对METH诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响 (n=3，xˉ±s，%)

Tab. 3 Effects of CCK-8 on the apoptosis rateinduced by METH in SH-SY5Y cellsdetected by flow cytometry

组别	细胞凋亡率
对照	8.13±0.70
METH	14.18±0.40
0.01 μmol/L CCK-8+METH	12.20±1.24
0.1 μmol/L CCK-8+METH	10.56±0.15^1）
1 μmol/L CCK-8+METH	10.77±0.29^1）
0.01 μmol/L CCK-8	5.76±0.73
0.1 μmol/L CCK-8	5.53±0.89
1 μmol/L CCK-8	5.95±0.84

图5 Hoechst 33258染色检测凋亡细胞核的形态学变化A：对照组；B：METH组；C：1 μmol/L CCK-8+METH组；D：1 μmol/L CCK-8组。红色箭头所示为碎裂、固缩的细胞核。Bar=25 μm。

Fig. 5 Morphological changes of apoptotic nucleidetected by Hoechst 33258 staining

表4 CCK-8对METH诱导SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白的影响 (n=3，xˉ±s)

Tab. 4 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METH in SH-SY5Y cells

组别	Bax	Bcl-2	cleaved caspase-3	Bax/Bcl-2
对照	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
METH	1.65±0.15	0.90±0.04	1.66±0.09	1.83±0.10
0.01 μmol/L CCK-8+METH	1.46±0.08	1.16±0.13	1.33±0.10^1）	1.31±0.22^1）
0.1 μmol/L CCK-8+METH	1.33±0.11^1）	1.16±0.12	1.23±0.02^1）	1.18±0.19^1）
1 μmol/L CCK-8+METH	1.10±0.08^1）	1.29±0.13^1）	1.07±0.04^1）	0.86±0.08^1）

图6 Western印迹法检测CCK-8对METH诱导SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白的影响1：对照组；2：METH组；3：0.01 μmol/L CCK-8+METH组；4：0.1 μmol/L CCK-8+METH组；5：1 μmol/L CCK-8+METH组。

Fig. 6 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METH in SH-SY5Y cellsdetected by Western blotting

图7 明场和荧光下慢病毒空载体转染HEK293细胞的形态（×200）A、B为LV-CMV-mCherry-WPRE；C、D为LV-CMV-EGFP-WPRE。A、C为明场；B、D为荧光。

Fig. 7 Morphology of HEK293 cells transfected with lentivirus vectors under phase and fluorescence （×200）

图8 慢病毒转染HEK293细胞的激光共聚焦成像A、B、C为LV-CMV-mCherry-CCK1R-Flag-WPRE-pA；D、E、F为LV-CMV-EGFP-CCK2R-HA-WPRE-pA。A、D为CCK1R和CCK2R的荧光标记；B、E为DAPI；C、F为Merge。Bar=20 μm。

Fig. 8 The confocal images of lentivirus-transfected HEK293 cells

图9 Western印迹法检测CCK-8对METH诱导HEK293-CCK1R和HEK293-CCK2R细胞凋亡相关蛋白的影响A：HEK293-CCK1R；B：HEK293-CCK2R。

Fig. 9 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METHin HEK293-CCK1R and HEK293-CCK2R detected by Western blotting

表5 CCK-8对METH诱导HEK293-CCK1R和HEK293-CCK2R细胞凋亡相关蛋白的影响 (n=3，xˉ±s)

Tab. 5 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteinsinduced by METH in HEK293-CCK1R and HEK293-CCK2R

蛋白	HEK293-CCK1R				HEK293-CCK2R
蛋白	对照组	METH	CCK-8+METH	CCK-8	对照组	METH	CCK-8+METH	CCK-8
Bax	1.00±0.00	1.65±0.08	1.59±0.07	0.94±0.02	1.00±0.00	1.67±0.13	1.18±0.04^1）	1.11±0.13
Bcl-2	1.00±0.00	0.88±0.07	0.91±0.09	0.97±0.09	1.00±0.00	0.83±0.05	1.00±0.15	0.96±0.08
cleaved caspase-3	1.00±0.00	1.85±0.14	1.87±0.17	0.99±0.17	1.00±0.00	1.76±0.06	1.25±0.06^1）	1.02±0.10
Bax/Bcl-2	1.00±0.00	1.92±0.23	1.80±0.24	0.99±0.11	1.00±0.00	2.01±0.15	1.23±0.15^1）	1.15±0.04

图10 明场和荧光下siRNA转染SH-SY5Y细胞的形态（×200）A：明场；B：荧光。

Fig. 10 Morphology of SH-SY5Y cells transfected withsiRNA under phase and fluorescence （×200）

图11 Western印迹法检测不同siRNA序列转染的SH-SY5Y细胞β-arrestin 2的表达1：对照组；2：阴性对照组；3：β-arrestin 2 siRNA-1组；4：β-arrestin 2 siRNA-2组；5：β-arrestin 2 siRNA-3组。

Fig. 11 Expression of β-arrestin 2 in SH-SY5Y cellstransfected with different siRNA sequencesdetected by Western blotting

表6 siRNA干扰对SH-SY5Y细胞β-arrestin 2表达的影响 (n=3，xˉ±s)

Tab. 6 Effects of siRNA on the expressionof β-arrestin 2 in SH-SY5Y cells

组别	相对表达量
对照	1.00±0.00
阴性对照	1.09±0.06
β-arrestin 2 siRNA-1	0.96±0.06
β-arrestin 2 siRNA-2	0.61±0.04^1）
β-arrestin 2 siRNA-3	0.28±0.04^1）2）

图12 Western印迹法检测CCK-8对METH诱导β-arrestin 2敲减SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白的影响

Fig. 12 Effects of CCK-8 on the expression ofapoptosis-related proteins induced by METHin β-arrestin 2 knockdown SH-SY5Ydetected by Western blotting

表7 CCK-8对METH诱导β-arrestin 2敲减SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白的影响 (n=3，xˉ±s)

Tab. 7 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteinsinduced by METH in β-arrestin 2 knockdown SH-SY5Y

组别	Bax	Bcl-2	cleaved caspase-3	Bax/Bcl-2
对照	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
METH	1.81±0.04^1）	0.92±0.04	1.80±0.07^1）	1.98±0.13^1）
CCK-8+METH	1.79±0.09^1）	0.89±0.04	1.70±0.08^1）	2.02±0.02^1）
CCK-8	1.07±0.02	1.07±0.11	0.91±0.05	1.02±0.09

参考文献 23

1	ROPEK N， AL-SERORI H， MIŠÍK M， et al. Methamphetamine （“crystal meth”） causes induction of DNA damage and chromosomal aberrations in human derived cells[J]. Food Chem Toxicol，2019，128：1-7. doi：10.1016/j.fct.2019.03.035.
2	BÜTTNER A. Review： The neuropathology of drug abuse[J]. Neuropathol Appl Neurobiol，2011，37（2）：118-134. doi：10.1111/j.1365-2990.2010.01131.x.
3	WEN D， CONG B， MA C， et al. The effects of exogenous CCK-8 on the acquisition and expression of morphine-induced CPP[J]. Neurosci Lett，2012，510（1）：24-28. doi：10.1016/j.neulet.2011.12.063.
4	文迪，马春玲，丛斌，等. CCK-8与内源性阿片系统在吗啡依赖过程中的相互作用[J].中国药物依赖性杂志，2010，19（5）：422-423. doi：10.13936/j.cnki.cjdd1992.2010.05.031.
	WEN D， MA C L， CONG B， et al. Interaction of CCK-8 and endogenous opioid system in opioid dependence[J]. Zhongguo Yaowuyilaixing Zazhi，2010，19（5）：422-423.
5	WEN D， ZANG G， SUN D， et al. Effects of CCK-8 on the reinstatement of morphine-induced CPP and expression of behavioral sensitization in rats[J]. Neuroscience，2013，238：230-241. doi：10.1016/j.neuroscience.2013.02.057.
6	WEN D， AN M， GOU H， et al. Cholecystokinin-8 inhibits methamphetamine-induced neurotoxicity via an anti-oxidative stress pathway[J]. Neurotoxicology，2016，57：31-38. doi：10.1016/j.neuro.2016.08.008.
7	SUN D L， QI Y X， YANG T， et al. Early oral nutrition improves postoperative ileus through the TRPA1/CCK1-R-mediated mast cell-nerve axis[J]. Ann Transl Med，2020，8（5）：179. doi：10.21037/atm.2020.01.95.
8	YANG X， WANG Y， LI Q， et al. The main molecular mechanisms underlying methamphetamine- induced neurotoxicity and implications for pharmacological treatment[J]. Front Mol Neurosci，2018，11：186. doi：10.3389/fnmol.2018.00186.
9	LI S， NI Z， CONG B， et al. CCK-8 inhibits LPS-induced IL-1β production in pulmonary interstitial macrophages by modulating PKA， p38， and NF-κB pathway[J]. Shock，2007，27（6）：678-686. doi：10.1097/shk.0b013e3180ze26dd.
10	冯波，王蓉，盛树力. 神经退行性疾病研究中拟神经细胞模型：人神经母细胞瘤株SH-SY5Y的来源特性及应用[J].中国临床康复，2006，10（6）：121-123.
	FENG B， WANG R， SHENG S L. Mimic model of nerve cells in the study of neurodegenerative disease： Origin， characteristics and application of human neuroblastoma cell line SH-SY5Y[J]. Zhongguo Linchuang Kangfu，2006，10（6）：121-123.
11	HU X L， OLSSON T， JOHANSSON I M， et al. Dynamic changes of the anti- and pro-apoptotic proteins Bcl-w， Bcl-2， and Bax with Smac/Diablo mitochondrial release after photothrombotic ring stroke in rats[J]. Eur J Neurosci，2004，20（5）：1177-1188. doi：10.1111/j.1460-9568.2004.03554.x.
12	CHOUDHARY G S， AL-HARBI S， ALMASAN A. Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis[J]. Methods Mol Biol，2015，1219：1-9. doi：10.1007/978-1-4939-1661-0_1.
13	WISESSMITH W， PHANSUWAN-PUJITO P， GOVI-TRAPONG P， et al. Melatonin reduces induction of Bax， caspase and cell death in methamphetamine-treated human neuroblastoma SH-SY5Y cultured cells[J]. J Pineal Res，2009，46（4）：433-440. doi：10.1111/j.1600-079X.2009.00680.x.
14	TOSCANO E C B， VIEIRA É L M， PORTELA A C D C， et al. Bcl-2/Bax ratio increase does not prevent apoptosis of glia and granular neurons in patients with temporal lobe epilepsy[J]. Neuropatholo-gy，2019，39（5）：348-357. doi：10.1111/neup.12592.
15	YE G， TAO L， MA C， et al. Influences of CCK-8 on expressions of apoptosis-related genes in prefrontal cortex neurons of morphine-relapse rats[J]. Neurosci Lett，2016，631：115-121. doi：10.1016/j.neulet.2016.08.028.
16	WEN D， MA C L， ZHANG Y J， et al. Cholecystokinin receptor-1 mediates the inhibitory effects of exogenous cholecystokinin octapeptide on cellular morphine dependence[J]. BMC Neurosci，2012，13：63. doi：10.1186/1471-2202-13-63.
17	HÖKFELT T， MORINO P， VERGE V， et al. CCK in cerebral cortex and at the spinal level[J]. Ann N Y Acad Sci，1994，713：157-163. doi：10.1111/j.1749-6632.1994.tb44062.x.
18	VÁZQUEZ-LEÓN P， CAMPOS-RODRÍGUEZ C， GONZALEZ-PLIEGO C， et al. Differential effects of cholecystokinin （CCK-8） microinjection into the ventrolateral and dorsolateral periaqueductal gray on anxiety models in Wistar rats[J]. Horm Behav，2018，106：105-111. doi：10.1016/j.yhbeh.2018.10.003.
19	GOU H， WEN D， MA C， et al. Protective effects of cholecystokinin-8 on methamphetamine-induced behavioral changes and dopaminergic neurodegeneration in mice[J]. Behav Brain Res，2015，283：87-96. doi：10.1016/j.bbr.2015.01.028.
20	KAUFMANN A， RÖSSLER O G， THIEL G. Expression of the transcription factor Egr-1 in pancreatic acinar cells following stimulation of cholecystokinin or Galphaq-coupled designer receptors[J]. Cell Physiol Biochem，2014，33（5）：1411-1425. doi：10.1159/000358707.
21	LOONAM T M， NOAILLES P A H， YU J， et al. Substance P and cholecystokinin regulate neurochemical responses to cocaine and methamphetamine in the striatum[J]. Life Sci，2003，73（6）：727-739. doi：10.1016/s0024-3205（03）00393-x.
22	WANG H M， DONG J H， LI Q， et al. A stress response pathway in mice upregulates somatostatin level and transcription in pancreatic delta cells through Gs and β-arrestin 1[J]. Diabetologia，2014，57（9）：1899-1910. doi：10.1007/s00125-014-3290-0.
23	YIN W， LI Z， JIN M， et al. A complex structure of arrestin-2 bound to a G protein-coupled receptor[J]. Cell Res，2019，29（12）：971-983. doi：10.1038/s41422-019-0256-2.

[1]	杨锦萱, 田栋安, 唐欣雨, 赵展英, 荆奚悦, 王冬梅, 田小菲. 铁吸收异常在CO中毒致脑白质损伤中的作用[J]. 法医学杂志, 2025, 41(6): 545-551.
[2]	秦豪杰, 莫晨, 李洪伟, 刘之江, 郑哲. 铁死亡在小鼠百草枯急性肺损伤中的作用[J]. 法医学杂志, 2025, 41(5): 494-501.
[3]	陈轩龙, 袁强, 孙勇, 张碟, 伏建斌, 李立亮. 米酵菌酸中毒后死亡法医学鉴定1例[J]. 法医学杂志, 2025, 41(3): 277-280.
[4]	魏倩, 龚道银, 卢先洪, 唐莉, 卢翔, 李进财. 依托咪酯滥用死亡1例[J]. 法医学杂志, 2025, 41(3): 281-283.
[5]	周亦武, 刘良. 法医学中毒鉴定的挑战与展望[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 107-110.
[6]	陈轩龙, 袁强, 孙勇, 张碟, 伏建斌, 李立亮. 米酵菌酸中毒的法医学研究进展[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 111-119.
[7]	张帅, 许弘飞, 张志湘, 王盈, 朱少华. 阿霉素心脏毒性机制研究及法医学应用[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 120-126.
[8]	左雨蒙, 韩卫, 张建波, 李涛. 氯胺酮的分子生物学机制及毒性效应[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 127-135.
[9]	李卓, 曾绎如, 疏志龙, 孙雪虹, 张奎. 秀丽隐杆线虫模型毒理学研究现状及其法医学应用前景[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 136-143.
[10]	王荣帅, 黄锶哲, 王云云, 邓燕飞, 丁自娇, 张杰, 刘勇, 任亮, 刘良. 钙调控蛋白与核因子κB在急性MDMA染毒心肌细胞钙失衡中的作用机制[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 144-151.
[11]	王浩伟, 张晓星, 杨根梦, 王尚文, 曾晓锋. 铁死亡在α-鹅膏毒肽诱导肝细胞损伤中的作用[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 152-159.
[12]	李泽绮, 邢蕾, 张慧鸽, 何丽柔, 张佳奕, 汪佳琪, 刘世豪, 杨卫红. 美沙酮相关中毒案例分析[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 160-167.
[13]	余思, 夏静雪, 李长彬, 张刚彬, 张依平, 池雨欣, 杨卫红. 美沙酮治疗后死亡的药物代谢酶基因型分析1例[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 197-200.
[14]	余钢, 李国, 孙志炜, 张荆. 唑吡坦急性中毒死亡法医学鉴定1例[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 194-197.
[15]	杨辉煌, 刘霞, 王振, 石瑞, 史为博, 张国忠, 毕海涛, 李英敏. 敌草快中毒后延迟性死亡法医学鉴定1例[J]. 法医学杂志, 2025, 41(2): 181-184.