Development of a Multiplex PCR Amplification System of mini‑STR with Eight‑Dye Fluorescence and Its Application in Forensic Medicine

doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2024.540103

Abstract

Abstract:

Objective To develop an eight-dye fluorescent multiplex amplification system based on mini-STR and eight-dye fluorescent labeling technique, and to evaluate its applicability in the analysis of degraded samples in forensic medicine. Methods An eight-dye fluorescent labeling technique was used to develop a multiplex amplification system targeting 26 loci, including D22S1045, D13S317, CSF1PO, D2S441, D10S1248, TPOX, D16S539, D5S818, Penta D, TH01, D2S1338, Penta E, rs2032678,Amelogenin, D19S433, D21S11, D6S1043, D8S1179, vWA, D7S820, D1S1656, DYS391, D18S51, D12S391, D3S1358, and FGA. The established amplification system was evaluated and tested for its specificity, sensitivity, accuracy, and the ability to analyze degraded samples. Results An eight-dye fluorescent multiplex amplification system containing 26 loci was successfully developed. All amplicons were less than 310 bp in length. The system demonstrated high specificity, sensitivity, and accurate typing, and performed well in the analysis of degraded samples. Conclusion The mini-STR with the eight-dye fluorescent multiplex amplification system has good potential for the analysis of degraded samples and can be applied to forensic casework.

Key words: forensic genetics, short tandem repeat, eight-dye fluorescence, multiplex amplification, degraded sample

CLC Number:

Xin Wang, Yang Cui, Jinfeng Xuan, Weizhong Chen, Jian Zhang, Ruhua Zhou, Minghao Shi, Linli Chen. Development of a Multiplex PCR Amplification System of mini‑STR with Eight‑Dye Fluorescence and Its Application in Forensic Medicine[J]. Journal of Forensic Medicine, 2026, 42(4): 345-351.

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URL: http://www.fyxzz.cn/EN/10.12116/j.issn.1004-5619.2024.540103

http://www.fyxzz.cn/EN/Y2026/V42/I4/345

Figures/Tables 4

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基因座	片段长度范围/bp	等位基因范围	荧光标记	标准品9948分型
D22S1045	66~110	8~20	FAM	16/18
D13S317	111~163	5~16	FAM	11
CSF1PO	165~212	6~15	FAM	10/11
D2S441	214~258	7~17	FAM	10/11
D10S1248	259~309	8~19	FAM	12/15
TPOX	47~101	5~15	TET	8/9
D16S539	102~154	5~15	TET	11
D5S818	157~213	7~18	TET	11/13
Penta D	215~302	2.2~17	TET	8/12
TH01	62~110	4~13.3	HEX	6/9.3
D2S1338	114~194	11~29	HEX	23
Penta E	197~310	5~27	HEX	11
rs2032678	70~79	1，2	SUM	2
Amelogenin	81~90	X，Y	SUM	X/Y
D19S433	91~153	5~19.2	SUM	13/14
D21S11	154~222	24~38	SUM	29/30
D6S1043	226~305	7~25	SUM	12
D8S1179	69~135	5~20	LYN	12/13
vWA	136~201	10~25	LYN	17
D7S820	202~250	6~15	LYN	11
D1S1656	255~310	9~20.3	LYN	14/17
DYS391	66~111	5~14	PUR	10
D18S51	114~220	7~31	PUR	15/18
D12S391	221~284	14~28	PUR	18/24
D3S1358	70~127	9~20	H13	15/17
FGA	130~290	13~50.2	H13	24/26

基因座	片段长度范围/bp	等位基因范围	荧光标记	标准品9948分型
D22S1045	66~110	8~20	FAM	16/18
D13S317	111~163	5~16	FAM	11
CSF1PO	165~212	6~15	FAM	10/11
D2S441	214~258	7~17	FAM	10/11
D10S1248	259~309	8~19	FAM	12/15
TPOX	47~101	5~15	TET	8/9
D16S539	102~154	5~15	TET	11
D5S818	157~213	7~18	TET	11/13
Penta D	215~302	2.2~17	TET	8/12
TH01	62~110	4~13.3	HEX	6/9.3
D2S1338	114~194	11~29	HEX	23
Penta E	197~310	5~27	HEX	11
rs2032678	70~79	1，2	SUM	2
Amelogenin	81~90	X，Y	SUM	X/Y
D19S433	91~153	5~19.2	SUM	13/14
D21S11	154~222	24~38	SUM	29/30
D6S1043	226~305	7~25	SUM	12
D8S1179	69~135	5~20	LYN	12/13
vWA	136~201	10~25	LYN	17
D7S820	202~250	6~15	LYN	11
D1S1656	255~310	9~20.3	LYN	14/17
DYS391	66~111	5~14	PUR	10
D18S51	114~220	7~31	PUR	15/18
D12S391	221~284	14~28	PUR	18/24
D3S1358	70~127	9~20	H13	15/17
FGA	130~290	13~50.2	H13	24/26

基因座	引物序列（5’→3’）	引物浓度/（μmol·L^-1）
D22S1045	正向引物：GATTTTCCCCGATGATAGTAGTCTC	0.078
D22S1045	反向引物：GCGAATGTATGATTGGCAATATTTTTA	0.078
D13S317	正向引物：CATCCGTGACTCTCTGGACTC	0.084
D13S317	反向引物：GGCCCAAAAAGACAGACAGAAAG	0.084
CSF1PO	正向引物：CCTTCTCAGATACTATCTCCTGGTG	0.072
CSF1PO	反向引物：GCTGTGTCTCAGTTTTCCTACCT	0.072
D2S441	正向引物：CTAGAGTCCTGCCTTGGGG	0.096
D2S441	反向引物：GCTTTTAAATTGGAGCTAAGTGGC	0.096
D10S1248	正向引物：ACCAAAGCATGAACAATCAGTAAAA	0.192
D10S1248	反向引物：TGGCAAAGAGCAGATGCTAAAA	0.192
TPOX	正向引物：CTGGTCTTACTCCTGTTCCCTT	0.060
TPOX	反向引物：GGCACAGAACAGGCACTTAG	0.060
D16S539	正向引物：CCATCTCTGTTTTGTCTTTCAATGA	0.120
D16S539	反向引物：ACAGACAGACAGACAGGTGG	0.120
D5S818	正向引物：TGCTTTTTAGCCAAGTGATTCCA	0.084
D5S818	反向引物：GAATAGCAAGTATGTGACAAGGGTG	0.084
Penta D	正向引物：GAAGAGTAGAACTTTTAAGTTTTGATGAA	0.084
Penta D	反向引物：GTGACAGAGCAAGACACCATC	0.084
TH01	正向引物：TGTTCCTCCCTTATTTCCCTCATT	0.132
TH01	反向引物：GTCCGAGTGCAGGTCACAG	0.132
D2S1338	正向引物：TCAGTAAGTTAAAGGATTGCAGGAG	0.144
D2S1338	反向引物：GATAATCCAGCTGTGGGAGGG	0.144
Penta E	正向引物：TACATAACATACATGTGTGTAAAGTGCT	0.180
Penta E	反向引物：CCAGGAGGTGGAGATTGAAGT	0.180
rs2032678	正向引物：CTCAACTCCAGTGATTTAAACTCTCT	0.120
rs2032678	反向引物：GATACCTTTGTTTCTGTTCATTCTTG	0.120
Amelogenin	正向引物：CCTGGGCTCTGTAAAGAATAGT	0.096
Amelogenin	反向引物：GCTGGTGGTAGGAACTGTAAAAT	0.096
D19S433	正向引物：CATTACCCGAATAAAAATCTTCTCTCTT	0.108
D19S433	反向引物：GCCTGGGCAACAGAATAAGAT	0.108
D21S11	正向引物：GGTAGATAGACTGGATAGATAGACGA	0.168
D21S11	反向引物：GGTCAATTCCCCAAGTGAATTGC	0.168
D6S1043	正向引物：ATAATTGTATGAGCCACTTCCCA	0.156
D6S1043	反向引物：AAGTACCCTAACAAGTAACTCATCATC	0.156
D8S1179	正向引物：CTGTAGATTATTTTCACTGTGGGGA	0.180
D8S1179	反向引物：GGTTTTGTATTTCATGTGTACATTCGTAT	0.180
vWA	正向引物：GATGTGAAAGCCCTAGTGGATG	0.156
vWA	反向引物：GAGATAGGACAGATGATAAATACATAGGA	0.156
D7S820	正向引物：TAACGATTCCACATTTATCCTCATTGA	0.360
D7S820	反向引物：GGCTGACTATGGAGTTATTTTAAGGTT	0.360
D1S1656	正向引物：AATTCTCCTTCAGTCCTGTGTTAGT	0.204
D1S1656	反向引物：TCATGTTGAGTAGGCTGAGAAGG	0.204
DYS391	正向引物：TCATACACCCATATCTGTCTGTCTG	0.084
DYS391	反向引物：GGATAGGTAGGCAGGCAGAT	0.084
D18S51	正向引物：GTGTGGAGATGTCTTACAATAACAGT	0.156
D18S51	反向引物：GTGACAAATTGAGACCTTGTCTC	0.156
D12S391	正向引物：GAAAGAATCAACAGGATCAATGGA	0.132
D12S391	反向引物：CCCTGGTTTTTTGGCTTTTAGAC	0.132
D3S1358	正向引物：ATCAACAGAGGCTTGCATGTATC	0.132
D3S1358	反向引物：GAGAGCAAGACCCTGTCTCATAG	0.132
FGA	正向引物：TGAGTGATTTGTCTGTAATTGCCA	0.132
FGA	反向引物：GCTGTAACCAAAATAAAATTAGGCATAT	0.132

基因座	引物序列（5’→3’）	引物浓度/（μmol·L^-1）
D22S1045	正向引物：GATTTTCCCCGATGATAGTAGTCTC	0.078
D22S1045	反向引物：GCGAATGTATGATTGGCAATATTTTTA	0.078
D13S317	正向引物：CATCCGTGACTCTCTGGACTC	0.084
D13S317	反向引物：GGCCCAAAAAGACAGACAGAAAG	0.084
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D2S441	正向引物：CTAGAGTCCTGCCTTGGGG	0.096
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D10S1248	正向引物：ACCAAAGCATGAACAATCAGTAAAA	0.192
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D16S539	正向引物：CCATCTCTGTTTTGTCTTTCAATGA	0.120
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Penta D	正向引物：GAAGAGTAGAACTTTTAAGTTTTGATGAA	0.084
Penta D	反向引物：GTGACAGAGCAAGACACCATC	0.084
TH01	正向引物：TGTTCCTCCCTTATTTCCCTCATT	0.132
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D2S1338	正向引物：TCAGTAAGTTAAAGGATTGCAGGAG	0.144
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Penta E	正向引物：TACATAACATACATGTGTGTAAAGTGCT	0.180
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rs2032678	正向引物：CTCAACTCCAGTGATTTAAACTCTCT	0.120
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Amelogenin	正向引物：CCTGGGCTCTGTAAAGAATAGT	0.096
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D19S433	正向引物：CATTACCCGAATAAAAATCTTCTCTCTT	0.108
D19S433	反向引物：GCCTGGGCAACAGAATAAGAT	0.108
D21S11	正向引物：GGTAGATAGACTGGATAGATAGACGA	0.168
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D6S1043	正向引物：ATAATTGTATGAGCCACTTCCCA	0.156
D6S1043	反向引物：AAGTACCCTAACAAGTAACTCATCATC	0.156
D8S1179	正向引物：CTGTAGATTATTTTCACTGTGGGGA	0.180
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vWA	正向引物：GATGTGAAAGCCCTAGTGGATG	0.156
vWA	反向引物：GAGATAGGACAGATGATAAATACATAGGA	0.156
D7S820	正向引物：TAACGATTCCACATTTATCCTCATTGA	0.360
D7S820	反向引物：GGCTGACTATGGAGTTATTTTAAGGTT	0.360
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D1S1656	反向引物：TCATGTTGAGTAGGCTGAGAAGG	0.204
DYS391	正向引物：TCATACACCCATATCTGTCTGTCTG	0.084
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D18S51	反向引物：GTGACAAATTGAGACCTTGTCTC	0.156
D12S391	正向引物：GAAAGAATCAACAGGATCAATGGA	0.132
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D3S1358	反向引物：GAGAGCAAGACCCTGTCTCATAG	0.132
FGA	正向引物：TGAGTGATTTGTCTGTAATTGCCA	0.132
FGA	反向引物：GCTGTAACCAAAATAAAATTAGGCATAT	0.132

编号	样本类型	SA/ng	LA/ng	SA与LA的比值
1	正常9948	1.020	0.994	1.026
2	9948-高温处理	0.358	0.030	11.933
3	9948-高温处理	0.385	0.035	11.000
4	9948-高温处理	0.397	0.037	10.730
5	9948-高温处理	0.344	0.031	11.097
6	9948-高温处理	0.362	0.031	11.677
7	9948-酶切处理	0.265	0.017	15.588
8	9948-酶切处理	0.324	0.024	13.500
9	9948-酶切处理	0.186	0.015	12.400
10	9948-酶切处理	0.412	0.024	17.167
11	9948-酶切处理	0.255	0.025	10.200
12	陈旧样本提取	0.546	0.065	8.400
13	陈旧样本提取	0.433	0.057	7.596
14	陈旧样本提取	0.377	0.026	14.500
15	陈旧样本提取	0.264	0.019	13.895
16	陈旧样本提取	0.329	0.015	21.933